同时检测CAP和KANA的荧光响应传感体系、制备方法和应用

本发明属于食品安全检测分析，涉及利用核酸适配体与磁性固相萃取技术、催化发卡组装核酸扩增及dnazyme循环剪切触发荧光信号等检测食品中抗生素的方法，具体为同时检测cap和kana的荧光响应传感体系、制备方法和应用。

背景技术：

1、在养殖、种植、食品生产等过程中，动物和植物可能会使用多种抗生素，因此食品中往往出现多种抗生素同时存在的情况。多种抗生素共存时，不同种类的抗生素之间可能存在相互作用或协同效应，而影响对其的检测。现有技术中，常规的检测方法也无法实现多种抗生素同时检测的目的，尤其是在食品领域，根本无法准确反应样品中存在哪种抗生素及其含量。

2、氯霉素(cap)是一种酰胺醇类抗生素，可作用于细菌核糖核蛋白体，阻挠蛋白质的合成，属于广谱抗生素，主要成分由委内瑞拉链霉菌的代谢物产生。过量氯霉素的积累可能引起人类再生障碍性贫血和白血病的发生，长期使用会引起神经炎症，菌落失调等问题。我国农业部2007年宣布，兽医学中禁止检出cap，我国对水产中氯霉素的检测底限为0.3μg/kg。

3、卡那霉素(kana)是一种氨基糖苷类抗生素，可以阻断细菌中蛋白的合成，属于广谱抗生素，由于其具有良好的杀菌效果被广泛作为预防和治疗传染病的兽药使用。卡那霉素通过动物源性食品中的残留在人体中积累，引起人类不良反应，如神经毒性、耳鸣、腹泻、耐药性、甚至死亡等。我国对卡那霉素的使用和检测标准由《中华人民共和国食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(gb 31650-2019)规定，其中卡那霉素的最大残留限量标准为50μg/kg，适用于牛、羊、猪肉、蜂蜜和蜂王浆等动物源性食品。

4、磁性固相萃取技术(magnetic solid-phase extraction,mspme)是一种新型的固相萃取技术，可以对复杂基质样品进行纯化和富集，是一种快速、有效的样品前处理方法。该技术保留了传统固相萃取技术的分离活性，比传统的固相萃取技术有更高选择性和分离效率，原因在于磁珠易于修饰且比表面积大，生物相容性强，所以是一种良好的生物传感平台开发载体。同时，该技术还可简化复杂的样品洗脱过程，具有更好的自动化程度，可实现对微量待测物质的高倍率富集，因此近年来取得了飞速发展，在食品检测、环境分析、药物治疗中发挥着重要作用。

5、催化发夹组装(catalytic hairpin assembly,cha)是一种新型的核酸扩增技术，具有多项优势。首先，它具有高灵敏度和高特异性，能够在极低的模板浓度下进行扩增，且只扩增目标序列，减少了错配扩增的可能性。其次，cha核酸扩增反应采用两个引物，其中一个引物是专门设计用于扩增目标序列，因此具有高特异性。再者，cha核酸扩增反应只需要20～30min就能完成扩增，比pcr更快，更便捷，且不需要昂贵的仪器设备。此外，cha核酸扩增反应可靠性高，可以通过多种方法进行验证。最后，cha核酸扩增反应成本低，适用于大规模应用。

6、dnazyme是一段具有特定序列的dna片段，可以在相关金属离子的催化下，对底物链进行剪切，实现信号的变化。dnazyme作为一种核酸检测工具有多项优势，包括高灵敏度、高特异性、简单易用、可靠性高、成本低和应用广泛。这种检测工具可以检测各种生物分子，如dna、rna和蛋白质等，广泛应用于生物医学、环境监测、食品安全等领域。

技术实现思路

1、解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明利用kana-aptamer与待测样品中的kana结合，从而暴露cdna1序列，触发cha反应，实现cy5荧光恢复；利用cap-aptamer与待测样品中的cap结合，暴露cdna2序列，触发dnazyme循环剪切发卡h3，实现fam荧光恢复。鉴于此，本发明提供了同时检测cap和kana的荧光响应传感体系、制备方法和应用。

2、技术方案：同时检测cap和kana的荧光响应传感体系，所述传感体系包括经kana-aptamer及其互补序列cdna1、cap-aptamer及其互补序列cdna2修饰的fe3o4@au纳米粒；其中，cdna1序列为seq id no.1：5’-s-ttttttttttcctccctttgtcggcttagcct-3’，kana-aptamer序列为seq id no.2：5’-agatgggggttgaggctaagccga-3’，cdna2序列为seq idno.3：5’-s-tttttttttttctcttctccgagccggtcgaaatagtgaactaccac-3’，cap-aptamer序列为seq id no.4：5’-acttcagtgagttgtcccacggtcggcgagtcggtggtagttcact-3’。

3、优选的，所述传感体系包括两端分别修饰荧光基团cy5和猝灭基团bhq3的发卡结构h1，发卡结构h2，及两端分别修饰荧光基团fam和猝灭基团bhq1的发卡结构h3；其中，h1序列为seq id no.5：cy5-tttgtcggcttatcgctaaaacacaggctaagccgacaaagggagg-bhq3，h2序列为seq id no.6：ttaacgctaaaacacaggcttttgtcggcttagcctgtgttttagcgataagcc，h3序列为seq id no.7：fam-aaaaaatttttcactatraggaagagattttttt-bhq1。

4、以上所述同时检测cap和kana的荧光响应传感体系的制备方法，包括以下步骤：

5、s1、fe3o4磁珠氨基化

6、将fecl3·6h2o溶解于乙二醇中，搅拌澄清后加入ch3coona和组氨酸混匀，高温反应后采用乙醇清洗、干燥；

7、s2、合成金纳米粒

8、将haucl4溶液加热至沸腾后，加入柠檬酸钠溶液，搅拌反应得到aunps溶液；

9、s3、制备fe3o4@aunps

10、向s2制得的金纳米粒溶液中加入s1氨基化后的fe3o4磁珠，超声处理，4℃下恒温摇床上孵育过夜，pbs清洗并磁分离，制得fe3o4@au nps；

11、s4、制备fe3o4@au@dna nps

12、将cdna1、kana-aptamer、cdna2、cap-aptamer分别与pbs溶液混合制成dna溶液，分别将cdna1和kana-aptamer混合、cdna2和cap-aptamer混合，孵育后涡旋振荡，然后同时加入fe3o4@au nps中，充分混合后置于-20℃条件下孵育，然后常温放置并用pbs溶液分离清洗，重悬至pbs溶液中，4℃保存。

13、优选的，s1中fecl3·6h2o、ch3coona和组氨酸的物质的量比为1:18-24:4-8，fecl3·6h2o与乙二醇的配比为每1mmol的fecl3·6h2o对应40ml乙二醇溶液；反应温度为200-240℃，反应时间为12-16h，大量乙醇清洗后在60℃条件下干燥。

14、优选的，s2中haucl4溶液和柠檬酸钠溶液的浓度比为1:1，体积比为40:1。

15、优选的，s3中氨基化的fe3o4磁珠质量浓度为10-25mg/ml，与加入的aunps溶液的体积比为1:100。

16、优选的，s4中dna溶液浓度为1-10μm，使用终浓度为0.1-2μm，两种dna溶液按体积比1:1混合；fe3o4@au nps溶液和dna溶液的体积比为4:1。

17、以上所述的同时检测cap和kana的荧光响应传感体系在检测食品中微量氯霉素和卡那霉素中的应用。

18、优选的，所述应用的具体步骤为：

19、(1)在含氯霉素和卡那霉素的待测样品中，加入fe3o4@au@dnanps，30℃摇床孵育60-90min，磁分离移除上清液，加入h1、h2、h3与mn2+，涡旋混合，25℃摇床孵育60-90min后检测518nm和665nm处的荧光强度；其中，h1、h2、h3浓度为600nm，mn2+浓度100μm。

20、(2)根据荧光强度及荧光强度与氯霉素或卡那霉素浓度的标准曲线计算待测样品中的氯霉素、卡那霉素浓度；其中，氯霉素浓度与荧光强度的标准曲线为y＝270.322x+3932.559，卡那霉素与荧光强度的标准曲线为y＝217.411x+2738.968，x为氯霉素/卡那霉素的浓度、y为荧光强度。

21、优选的，荧光响应传感体系对氯霉素的检测限低至28.03am、对卡那霉素的检测限低至32.03am，线性范围均为0.1fm-1nm。

22、本发明所述荧光响应传感体系的构建及工作原理在于：fe3o4磁珠经氨基化后，在其表面修饰au nps，随后在fe3o4@au nps上同时修饰cdna1和kana-aptamer的互补双链及cdna2与cap-aptamer的互补双链，构建分散型固相微萃取荧光响应传感体系。所述传感体系在cap与kana存在的环境中，当kana存在时，kana与kana-aptamer结合，暴露cdna1的黏性末端，进而打开两端修饰有荧光基团cy5和猝灭基团bhq3的发卡结构h1，实现荧光恢复，形成cdna/h1结构。该结构进而继续打开发卡结构h2，从而置换下cdna1，最终产生h1/h2荧光结构。cdna1在体系中循环反应构建h1/h2双链结构，实现kana荧光检测信号的增强。cap与cap-aptamer结合，暴露cdna2黏性末端。cdna2作为dnazyme酶，与两端修饰荧光基团fam和猝灭基团bhq1的发卡结构h3结合，在mn2+催化下循环剪切h3，使原本紧挨的猝灭基团和荧光基团发生远离，被猝灭的荧光信号恢复，实现cap荧光检测信号的增强。

23、有益效果：(1)本发明借助磁分离特性实现分析物富集，有效实现分析物从复杂基质中分离富集，简化前处理步骤；(2)通过适配体的选择可以实现多种抗生素特异性检测，同时借助核酸放大技术能够大幅提高检测方法准确度和灵敏度，适用于超微量多种抗生素的检测；(3)本发明将抗生素含量转化为荧光仪器的荧光强度值，检测方法操作简单便捷，检测迅速。该方法使用荧光光谱仪进行荧光信号检测，卡那霉素和氯霉素检出限低至32.03am和28.03am，线性范围为0.1fm-1nm。