结合B7-H3的抗原结合蛋白的制作方法

本公开提供了与b7-h3特异性结合的抗原结合蛋白和编码所述抗原结合蛋白的核酸、包含所述核酸的载体、携带所述载体的宿主细胞和其使用方法。

背景技术：

1、b7家族检查点分子已经成为癌症研究的前沿，其概念是肿瘤细胞利用它们来逃避免疫监视。b7家族分子能够控制和抑制t细胞以及nk细胞的免疫应答。不断增长的b7家族现在包含10名成员，所述成员是cd80(也被称为b7.1)、cd86(也被称为b7.2)、b7-h1(也被称为pd-l1或cd274)、b7-dc(也被称为pd-l2或cd273)、b7-h2(也被称为icosl)、b7-h3(也被称为cd276)、b7-h4(也被称为b7s1、b7x或vtcn1)、b7-h5(也被称为vista、gi24、dies1或pd-1h)、b7-h6(也被称为ncr3lg1)和b7-h7(也被称为hhla2)。令人信服的证据表明，b7分子不仅提供刺激和支持t细胞作用的关键阳性信号，还提供控制和抑制t细胞应答的阴性信号。

2、b7同源3蛋白(b7-h3)(也被称为cd276和b7rp-2，并且本文中被称为“b7-h3”)是免疫球蛋白超家族的i型跨膜糖蛋白。人b7-h3含有n末端处的信号肽、胞外免疫球蛋白样可变区(ig样v-1型)和恒定区(ig样c2-1型)、跨膜区和具有45个氨基酸的胞质尾区(zhou y.h.等人,2007,《组织抗原(tissue antigens).70(2):96-104)。b7-h3具有三个剪接变体，b7-h3α和b7-h3β。b7-h3α的胞外结构域由免疫球蛋白样v型-ig样c型(也被称2igb7-h3)的两个ig结构域组成，而b7-h3β的胞外结构域由ig样v型-ig样c型-ig样v型-ig样c型(又被称4igb7-h3)的四个免疫球蛋白结构域组成。人组织和细胞系中的主要b7-h3同种型是4igb7-h3同种型(steinberger等人,2004,《免疫学杂志(j.immunol.)》172(4):2352-9)。

3、据报道，b7-h3具有共刺激和共抑制信号传导功能(参见例如，chapoval等人,2001,《自然免疫学(nat.immunol.)》2:269-74；suh等人,2003,《自然免疫学》4:899-906；prasad等人,2004,《免疫学杂志》173:2500-6；以及wang等人,2005,《欧洲免疫学杂志(eur.j.immunol.)》35:428-38；yang,s.等人,2020,《国际生物科学杂志(int.j.biol.sci.)》16(11):1767-1773)。例如，体外研究显示了b7-h3的共刺激功能，因为b7-h3被显示在存在刺激性抗cd3抗体以模拟t细胞受体信号的情况下诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的增殖并上调干扰素γ(ifn-γ)的产生(chapoval等人,2001,《自然免疫学》2:269-74)。此外，在b7-h3敲除/缺陷-/-小鼠中使用心脏同种异体移植物的体内研究显示，与同窝野生型对照相比，关键细胞因子、趋化因子和趋化因子受体mrna转录本(例如，il-2、ifn-γ、单核细胞趋化蛋白(mcp-1)和ifn-诱导蛋白(ip)-10)的产生减少(wang等人,2005,《欧洲免疫学杂志》35:428-38)。相比之下，例如在小鼠中观察到b7-h3共抑制功能，其中b7-h3蛋白抑制t细胞激活和效应细胞因子产生(suh等人,2003,《自然免疫学》4:899-906)。尽管尚未发现人b7-h3的配体，但已发现鼠b7-h3与髓样细胞触发受体(trem)(如转录本2(tlt-2)，一种适应性先天免疫细胞应答的调节剂)结合。鼠b7-h3与cd8+t细胞上的tlt-2的结合诱导t细胞效应子功能，如增殖、细胞毒性和细胞因子产生(hashiguchi等人,2008,《美国国家科学院院刊(proc.nat'l.acad.sci.u.s.a.)》105(30):10495-500)。

4、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)(mga271)是一种靶向b7-h3的人源化mab，通过募集nk细胞来对抗多种肿瘤类型，从而介导有效的抗体依赖性细胞毒性(adcc)。例如，在治疗表达b7-h3的难治性肿瘤如黑色素瘤和表达b7-h3的肿瘤包括骨肉瘤和尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma)中对其进行了研究。此外，mga271在表达b7-h3的肾细胞和膀胱癌的异种移植模型中表现出有效的抗肿瘤活性。在食蟹猴中，毒理学研究没有发现显著的安全性发现(loo,d.等人,2012,《临床癌症研究(clin.cancer res.)》18:3834-45)。

5、b7-h3蛋白在正常组织和细胞中不表达或低表达，但在各种肿瘤(实体瘤以及血液系统恶性病)中高表达，并与肿瘤进展、患者存活率和疾病预后密切相关。据临床报道，b7-h3在许多类型的癌症中过表达，所述癌症包括前列腺癌、肾透明细胞癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、急性髓性白血病(aml)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma，nhl)、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌(renalcancer)、肝细胞癌、肾癌(kidney cancer)、头颈癌、下咽鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、尿路上皮癌和尿路上皮细胞癌。虽然b7-h3在癌细胞中的作用尚不清楚，但它的表达可能会协调信号传导事件(和/或介导细胞间接合)，从而可以保护癌细胞免于先天和适应性免疫应答。例如，b7-h3在高级别前列腺上皮内瘤变和前列腺腺癌中过表达，并且b7-h3在这些癌细胞中的高表达水平与外科手术后癌症进展的风险增加相关(roth等人,2007,《癌症研究(cancer res.)》67(16):7893-900)。进一步，nsclc中的肿瘤b7-h3表达与肿瘤浸润性淋巴细胞数量呈负相关，并且与淋巴结转移显著相关(sun等人,2006,《肺癌(lung cancer)》53(2):143-51)。nsclc患者中循环可溶性b7-h3(sb7-h3)多肽的水平也与指示侵袭性疾病进展的更晚期的肿瘤分期、增大/增加的肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移相关(yamato等人,2009,《英国癌症杂志(br.j.cancer)》101(10):1709-16)。

6、尽管b7-h3对t细胞具有共抑制功能和共刺激功能，但肿瘤细胞或弥漫性肿瘤血管系统上的表达与死亡和致命结果的风险增加显著相关。靶向b7-h3不仅增强抗肿瘤免疫，而且抑制肿瘤血管生成，推测是通过与血管相关巨噬细胞表达的b7-h3接合，已知巨噬细胞通过细胞因子分泌促进肿瘤血管生成。

7、有报道称b7-h3分子与自身免疫性疾病相关。在风湿病和其它自身免疫性疾病中，据报道b7-h3对于成纤维母细胞样滑膜细胞与激活的t细胞之间的相互作用是重要的(yih-wen,c.等人,2008,《癌症药靶最新研究进展(current cancer drug targets)》8:404-413)，并且b7-h3激活的巨噬细胞据报道是败血症释放细胞因子的共刺激因子，并与败血症的发展有关(harlow,e.和lane,d.:“抗体：实验室手册(antibodies:a laboratorymanual)”,1988,冷泉港实验室(cold spring harbor laboratory))。另外，在小鼠哮喘模型的诱导期施用抗b7-h3抗体抑制了局部淋巴结中th2细胞诱导的细胞因子的产生，并且哮喘得以改善(leitner,j.等人,2009,《欧洲免疫学杂志》39:1754-1764)。

8、因此，b7-h3是用抗体靶向的有吸引力的抗原。本公开提供了与b7-h3特异性结合的b7-h3结合蛋白，具体地抗b7-h3抗体或其抗原结合部分以及其用途。

技术实现思路

1、一方面，本文提供了抗b7-h3抗原结合蛋白或完全人抗b7-h3抗体或其抗原结合片段，所述抗b7-h3抗原结合蛋白或完全人抗b7-h3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链cdr2和重链cdr3，并且所述轻链可变区包含轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3；并且所述重链cdr1具有seq idno:12的氨基酸序列，所述重链cdr2具有seq id no:13的氨基酸序列，所述重链cdr3具有seq id no:14的氨基酸序列，所述轻链cdr1具有seq id no:15的氨基酸序列，所述轻链cdr2具有seq id no:16的氨基酸序列，并且所述轻链cdr3具有seq id no:17的氨基酸序列。在实施方式中，所述重链可变区与seq id no:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，并且所述轻链可变区与seq id no:11的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

2、一方面，本文提供了一种抗原结合蛋白或完全人抗b7-h3抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合蛋白或完全人抗b7-h3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与seq id no:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，并且所述轻链可变区与seq id no:11的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

3、一方面，本文提供了一种抗原结合蛋白或完全人抗b7-h3抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合蛋白或完全人抗b7-h3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含seq id no:10和11的氨基酸序列(例如，本文中被称为va)。

4、在实施方式中，所述抗原结合片段包括fab片段。在实施方式中，所述抗原结合片段包括单链抗体，其中所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域用肽接头连接在一起。在实施方式中，所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种包括igg抗体，如igg1、igg2、igg3或igg4类抗体。在实施方式中，所述igg抗体为igg1或igg4抗体。在实施方案中，所述igg1抗体包含突变fc区。在实施方式中，所述突变fc区包含选自l234a和l235a的一个或多个突变。在实施方式中，所述突变fc区包含l234a和l235a(lala)突变。在实施方式中，所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种以10-7m或更小的kd与人抗b7-h3蛋白结合。

5、一方面，本文提供了一种药物组合物，其包括所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种以及药学上可接受的赋形剂。

6、一方面，本文提供了一种试剂盒，其包括所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种以及药学上可接受的赋形剂。

7、一方面，本文提供了一种核酸，其编码包含所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述重链可变区的多肽。

8、一方面，本文提供了一种核酸，其编码包含所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述轻链可变区的多肽。

9、一方面，本文提供了一种核酸，其编码(i)包含所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述重链可变区的第一多肽，以及(ii)包含所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述轻链可变区的第二多肽。

10、一方面，本文提供了一种载体，其包括所公开的核酸中的任一种。

11、一方面，本文提供了一种宿主细胞，其携带所公开的载体中的任一种。在实施方式中，所公开的载体包括表达载体，并且所述宿主细胞表达包含所述重链可变区的多肽。在实施方式中，所公开的载体包括表达载体，并且所述宿主细胞表达包含所述轻链可变区的多肽。

12、一方面，本文提供了一种宿主细胞，其携带第一载体和第二载体。在实施方式中，所述第一载体包含第一表达载体，所述第二载体包含第二表达载体，并且所述宿主细胞表达分别包含所述重链可变区和所述轻链可变区的第一多肽和第二多肽。

13、一方面，本文提供了一种用于制备包含抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区的多肽的方法，所述方法包括：在适于表达包含所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区的所述多肽的条件下培养所述宿主细胞的群。在实施方式中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞回收包括所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区的经表达的多肽。

14、一方面，本文提供了一种用于制备包含抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区的多肽的方法，所述方法包括：在适于表达包含所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区的所述多肽的条件下培养所述宿主细胞的群。在实施方式中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞回收包括所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区的经表达的多肽。

15、一方面，本文提供了一种用于制备以下的方法：(i)包含抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区的第一多肽；以及(ii)包含抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区的第二多肽，所述方法包含：在适于表达(i)所述第一多肽和(ii)所述第二多肽的条件下培养所述宿主细胞群。在实施方式中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞回收(i)经表达的第一多肽和(ii)经表达的第二多肽。

16、一方面，本文提供了一种用于抑制表达b7-h3的细胞的生长或增殖的方法，所述方法包含：在适于抑制所述表达b7-h3的细胞的生长或增殖的条件下，在存在所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的情况下，使效应细胞群与表达b7-h3的靶细胞群接触。在实施方式中，所述效应细胞群包含pbmc或nk细胞。在实施方式中，所述靶细胞群包含表达b7-h3的人源癌细胞或表达b7-h3的转基因细胞。在实施方式中，所述效应细胞与所述靶细胞的比率为1-5:1，如1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。在实施方式中，所述效应细胞与所述靶细胞的比率为5-10:1、10-20:1或20-30:1。在一些实施方式中，所述方法为体外方法。在一些实施方式中，所述靶细胞处于对象体内，并且所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段施用于所述对象。所述效应细胞也可以处于所述对象体内。

17、一方面，本文提供了一种用于杀伤表达b7-h3的细胞的方法，所述方法包含：在适于杀伤所述表达b7-h3的细胞的条件下，在存在所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的情况下，使效应细胞群与表达b7-h3的靶细胞群接触。在实施方式中，所述效应细胞群包含pbmc或nk细胞。在实施方式中，所述靶细胞群包括表达b7-h3的人源癌细胞或表达b7-h3的转基因细胞。在实施方式中，所述效应细胞与所述靶细胞的比率为1-5:1，如1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。在实施方式中，所述效应细胞与所述靶细胞的比率为5-10:1、10-20:1或20-30:1。在实施方式中，本文提供了一种恢复表达b7-h3的免疫细胞亚群的功能的方法。在一些实施方式中，所述方法为体外方法。在一些实施方式中，所述靶细胞处于对象体内，并且所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段施用于所述对象。所述效应细胞也可以处于所述对象体内。

18、一方面，本文提供了一种用于治疗患有与b7-h3表达相关的疾病的对象的方法，所述方法包括：向所述对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含所公开的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段中的任一种。在实施方式中，与b7-h3表达相关的疾病是癌症。在实施方式中，所述癌症为卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、皮肤癌、胰腺癌、肾癌、尿路上皮癌或肺癌。在实施方式中，所述癌症为急性髓性淋巴瘤(aml)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌、尿路上皮细胞癌、食管癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、口腔癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(tnbc)、淋巴瘤、肾细胞癌、肾透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、肛门癌、子宫内膜癌、外阴癌、鳞状细胞瘤、下咽鳞状细胞癌和鳞状细胞癌(例如，鳞状细胞肺癌或鳞状细胞头颈癌)。在实施方式中，所述癌症，如上文列出的癌症中的任一种癌症，为转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。