一种提高GMP体系下脐带间充质干细胞成骨分化的方法

本发明涉及干细胞，尤其涉及一种提高gmp体系下脐带间充质干细胞成骨分化的方法。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，mscs)，是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，如骨髓、血液、脐带、脐血、胎盘、脂肪等，具有调节炎症，抗凋亡和促血管生成的特性，是再生医学，炎症性疾病、高通量筛选和毒理学的优秀工具。它们在适当的诱导条件下可以分化为成骨细胞。人脐带间充质干细胞(uc-mscs)可以非侵入性收获，具有成骨分化和良好的增殖能力，低免疫原性和强免疫抑制能力，使它们在临床医学和骨组织工程方面有较广阔的前景。

2、mscs的成骨分化是鉴定mscs具有成骨能力的重要证据，是骨组织工程的基础。在成骨分化的过程中，成骨细胞首先合成1型胶原蛋白，骨钙素和骨桥蛋白等细胞外基质，通过小泡释放钙离子和碱性磷酸酶等酶类物质，钙离子在碱性磷酸酶的作用下沉积在胶原纤维丝上，完成细胞外基质矿物化过程，最终形成骨组织。矿化结节也叫骨结节是骨成熟的标志，也是骨组织行使功能的形态特征；而钙结节的形成则通过茜素红染色来鉴定。

3、随着科技的发展，干细胞作为一种细胞生物制剂来研究和生产已成为趋势。细胞生物制剂需符合《药品生产质量管理规范》(good manufacturing practice of medicalproducts，gmp)，生产细胞需使用不含动物源性物质的无血清培养基，同时添加成分明确的促生长的细胞添加剂，使用这种培养基培养的细胞和有血清培养基相比扩增后增殖能力更强。之前关于mscs成骨分化诱导使用的细胞大多是使用有血清培养基培养得到的，和gmp体系下无血清培养基相比，有血清体系培养的mscs增殖活性较弱，易于分化。研究表明，现有诱导方法对gmp体系下无血清培养生产的人脐带间充质干细胞(uc-mscs)成骨诱导效果很差，因此，需要对现有诱导方法进行优化。

技术实现思路

1、鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种提高gmp体系来源的脐带间充质干细胞向成骨分化的方法，用以解决现有诱导方法对gmp体系下无血清培养生产的人脐带间充质干细胞(uc-mscs)成骨诱导效果很差的问题。

2、本发明的目的主要是通过以下方案实现的：

3、本发明提供了一种提高gmp体系下脐带间充质干细胞成骨分化的方法，包括以下步骤：

4、s1：复苏细胞；

5、s2：细胞达到第一融合度时，用trypletmselect酶消化细胞，然后用磷酸盐缓冲液终止消化反应；

6、s3：将消化后的细胞悬液转移到尖底无菌离心管中，离心处理；

7、s4：弃去上清，用脐带间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并计数；

8、s5：对细胞培养皿进行包被处理；

9、s6：将细胞接种至包被处理的多孔板中，每孔加入脐带间充质干细胞无血清培养基，放置于培养箱中对细胞进行培养；

10、s7：细胞达到第二融合度时，弃去脐带间充质干细胞无血清培养基，每孔加入msc成骨诱导完全培养基，继续放置于培养箱中对细胞进行培养；

11、s8：第一诱导期，补加msc成骨诱导完全培养基，继续放置于培养箱中对细胞进行培养；

12、s9：第二诱导期，补加msc成骨诱导完全培养基，继续放置于培养箱中对细胞进行培养；

13、s10：第三诱导期，观察培养基中和细胞表面钙沉积和骨结节的形成情况，根据评价规则，判断是否停止诱导培养；

14、s11：诱导培养结束后，弃去培养上清，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，每孔加入中性多聚甲醛溶液，室温固定细胞；

15、s12：弃去固定液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，室温下每孔加入茜素红染液对细胞进行染色；

16、s13：弃去茜素红染液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞三次，添加新鲜pbs，显微镜下观察细胞表面的骨结节和钙沉积，对细胞表面的骨结节和钙沉积进行定量分析。

17、进一步地，步骤s2中，所述第一细胞融合度为90-95％。

18、进一步地，步骤s7中，所述第二细胞融合度为60-70％。

19、进一步地，步骤s8中，所述第一诱导期为诱导开始第5-7天；

20、进一步地，步骤s8中，所述补加msc成骨诱导完全培养基的量为300 -600μl/孔。

21、进一步地，步骤s9中，所述第二诱导期为诱导开始第10-14天。

22、进一步地，步骤s9中，所述补加msc成骨诱导完全培养基的量为300-600μl/孔。

23、进一步地，步骤s10中，所述第三诱导期为诱导开始第15-21天。

24、进一步地，步骤s10中，所述评价规则包括：

25、细胞表面钙沉积点＜5个且培养基中骨结节＞50个，则从培养基上层吸走500-1000μl培养基；

26、细胞表面钙沉积点＜5个且培养基中骨结节＜50个，则从培养基上层吸走500-1000μl培养基，并每孔补充msc成骨诱导完全培养基继续观察5-10天；

27、细胞表面钙沉积点＞50个，停止细胞诱导培养。

28、进一步地，所述补充msc成骨诱导完全培养基的量为300-600μl/孔。

29、与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：

30、1、与传统的频繁更换msc成骨诱导完全培养基进行成骨诱导的方法相比，本发明根据诱导周期，在诱导初期补充msc成骨诱导完全培养基的操作方法，通过合理的更换频次和体积设定，既能满足细胞营养的需求，又不至于使得培养基中的营养过于丰富，有利于人脐带间充质干细胞的成骨分化；同时，人脐带间充质干细胞在成骨分化过程中会分泌促进成骨分化的细胞因子，频繁更换msc成骨诱导完全培养基容易丢失这些促进成骨分化的细胞因子，本发明通过在诱导初期补充msc成骨诱导完全培养基的操作方法，可以使得细胞成骨分化过程中分泌的有利于分化的细胞因子累积，进一步促进细胞成骨分化，提高了人脐带间充质干细胞的成骨分化的效率和效果。

31、2、本发明通过使用常规的msc成骨诱导完全培养基，通过合理的更换频次和体积设定，在诱导初期补充msc成骨诱导完全培养基的操作方法，提高了人脐带间充质干细胞的成骨能力。

32、3、本发明的人脐带间充质干细胞成骨分化的方法同样适用于gmp体系下其他来源的间充质干细胞成骨的诱导，包括但不限于脂肪间充质干细胞，胎盘间充质干细胞，骨髓间充质干细胞，羊膜间充质干细胞，血液间充质干细胞等。本发明方法可用于间充质干细胞的体外成骨分化的鉴定，基于间充质干细胞的骨组织工程中骨组织体外诱导的探究。

33、本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。