表达Egt29基因的工程菌及其构建和应用的制作方法

本发明涉及基因工程，具体涉及表达egt29基因的工程菌及其构建和应用。

背景技术：

1、麦角硫因(ergothioneine，erg)是一种独特且非常稳定的天然抗氧化剂，与谷胱甘肽和抗坏血酸相比，erg可以清除非自由基的氧化物质，因此作为一种膳食补充剂和化妆品添加剂的需求正在增加。然而，作为一种天然化合物，人类和其他脊椎动物无法自我合成，它必须从食物中吸收。真菌、放线菌和蓝藻细菌等微生物能产生erg，但erg的产量非常低。因此，利用体外酶催化成为erg生产的主要途径。

2、基于高拷贝数质粒和t7噬菌体rna聚合宿主细胞的表达系统用于生产重组蛋白可以快速而容易地操纵，并且已经有了各种复制子质粒和突变体表达宿主。然而，以质粒为基础的大肠杆菌重组蛋白生产过程仍远非最佳的细胞系统。

3、首先，蛋白质合成是大肠杆菌中最具能量消耗的过程，诱导后重组蛋白快速的过度表达，造成重组蛋白非有效折叠，从而形成包涵体；同时，重组蛋白的产生也可触发应激反应，导致应激蛋白的高速率合成，造成宿主细胞代谢负担；因此，异源蛋白生产的高能量需求往往以生物量形成和重组蛋白发生降解为代价促进能量再生。另一个核心问题是在整个生物过程中质粒拷贝数(pcn)的不稳定性导致目的基因和质粒元件表达率的变化，重组基因表达诱导后pcn增加，高水平的蛋白生产导致质粒复制失控，由此产生的pcn的增加诱导了代谢负荷的级联放大；同时，构成型表达的抗生素耐药性基因产物，产生了额外的代谢负荷；两种现象最终产生致命的代谢负担，这都显著地导致了不稳定，并代表了基于质粒的系统在生产过程中的明显局限性。因此开发出一株具有高稳定表达系统且重组蛋白不易降解的菌株对于目前erg的生产具有重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一株表达egt29基因的工程菌及其构建和应用。本发明提供了基于无质粒的t7表达系统，构建的一株egt29基因高效表达的重组菌株，以及该菌株在生产麦角硫因中的应用。

2、本发明提供了egt29基因在构建生产麦角硫因的基因工程菌中或在制备生产麦角硫因的生物酶中的应用；

3、其中所述egt29基因具有如下任意一项所示的核酸序列：

4、(ⅰ)、如seq id no：1所示的核酸序列；或

5、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)所示的核酸序列不同的核酸序列；或

6、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核酸序列获得的核酸序列，且与(i)或(ii)所示的核酸序列功能相同或相似的核酸序列；或

7、(ⅳ)、与(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所述核酸序列具有至少90％序列同源性的核酸序列。

8、本发明对70个egt1同源酶进行筛选，发现相比其他同源酶，egt29酶具有更高的催化活性。egt29基因是egt1基因的同源基因，能够编码egt29酶，通过体外催化egt29酶能够进行麦角硫因的制备和生产，登录号为hay35766.1。

9、本发明提供了grna引物，其正向引物具有如seq id no：2所示的核酸序列，反向引物具有如seq id no：3所示的核酸序列。

10、利用本发明提供的grna引物构建的grna质粒，能够对目的基因进行基因编辑，包括将目的基因整合到宿主细胞的基因组中并进行稳定表达，或者敲除目的基因，相比其他grna质粒，本发明提供的grna质粒最不容易脱靶。

11、本发明提供了一株基因工程菌，其包括egt29基因或egt29基因编码的蛋白；其中所述egt29基因具有如下任意一项所示的核酸序列：

12、(ⅰ)、如seq id no：1所示的核酸序列；或

13、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)所示的核酸序列不同的核酸序列；或

14、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核酸序列获得的核酸序列，且与(i)或(ii)所示的核酸序列功能相同或相似的核酸序列；或

15、(ⅳ)、与(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所述核酸序列具有至少90％序列同源性的核酸序列。

16、本发明提供的基因工程菌以大肠杆菌为底盘菌，原始菌株通过发酵egt29酶产生麦角硫因，本发明通过将egt29基因导入底盘菌，能够获得生产egt29酶的基因工程菌株，本发明所述的底盘菌的菌株包括bl21菌株、dh5α菌株、bl21 plyss菌株、jm109菌株、top10菌株和hb101菌株。本发明实施例中选择bl21菌株作为底盘菌进行功能验证。其中，egt29基因可以以游离形式转入，也可以整合至底盘菌的基因组中，本发明对此不做限定。为了外源基因能够在表达宿主体内稳定表达，本发明实施例将egt29基因整合至大肠杆菌bl21的基因组。整合位点是ylbe基因、trpe基因或htga基因。进一步的，本发明还对egt29基因的拷贝数进行了增加，其拷贝数为1～5个，例如，可为1个、2个、3个、3个、4个或5个，在本发明中，当其拷贝数达到3时，能够产生足够多的可溶性蛋白，即能够发酵生产麦角硫因的酶。

17、为了进一步提高麦角硫因的产量，本发明在基因工程菌中加入伴侣蛋白。伴侣蛋白能够帮助蛋白质从头折叠，防止蛋白质聚集，维持蛋白质的稳态。伴侣蛋白构成的分子伴侣网络在蛋白质的展开和分解，以及靶向末端错误折叠的蛋白质进行蛋白降解等方面发挥作用。本发明所述伴侣蛋白选自trigger factor、dnak-dnaj、grpe和/或groel-groes中至少一种。例如，插入的伴侣蛋白的数量可以是1个、2个、3个或4个。本发明对伴侣蛋白的插入位点和插入顺序不做限定，其都在本发明的保护范围之内。一些具体实施例中，伴侣蛋白编码核酸的插入顺序为trigger factor、dnak-dnaj、grpe和groel-groes。具体的：

18、所述trigger factor的氨基酸序列的登录号为wp_001198386.1，核酸序列登录号为np_414970.1，gene id为945081；

19、所述dnak-dnaj中，dnak的氨基酸序列的登录号为wp_000516135.1，其核酸序列登录号为np_414555.1，gene id为944750；dnaj的氨基酸序列的登录号为wp_001118476.1，其核酸序列登录号为np_414556.1，gene id为944753；

20、所述grpe的氨基酸序列的登录号为wp_001393454.1，其核酸序列登录号为np_417104.1，gene id为947097；

21、所述groel-groes中，groel的氨基酸序列的登录号为wp_000729117.1，其核酸序列登录号为np_418567.1，gene id为948665，groes的的氨基酸序列的登录号为wp_001026276.1，其核酸序列登录号为np_418566.1，gene id为948655。

22、相对于其他伴侣蛋白，本发明采用的伴侣蛋白组合能更有效的促进egt29蛋白的表达。

23、进一步的，为了更进一步的提高麦角硫因的产量，本发明提供的基因工程菌中表达蛋白水解酶的clpb基因被敲除或敲低。所述敲除或敲低包括删除clpb基因的全长、替换clpb基因部分碱基序列、去除clpb基因的启动子或者插入突变、irna。本发明中，将clpb基因(蛋白序列登录号为wp_001235102.1，核酸序列登录号为np_417083.1，gene id为947077)中部分片段缺失，从而使其失活。但所述敲除或敲低clpb基因的方式不限于此，凡能使clpb基因失活的方式都在本发明的保护范围之内。

24、本发明提供的基因工程菌，其具有稳定的表达系统且体内的重组蛋白不易降解，在摇瓶培养的条件下与只表达egt29基因的对照菌株相比生长速率显著提高，在20h的浓度达到最大值，且没有发生自溶现象。所述基因工程菌中egt29基因表达的蛋白大部分为可溶性蛋白且包涵体较少，因此具有较高的单位酶活性。

25、本发明所述的基因工程菌，可以根据实际需要选择底盘菌。所述底盘菌体内自源含有底物n,n-三甲基组氨酸(her)、腺苷甲硫氨酸(sam)和半胱氨酸(cys)，则可作为生成麦角硫因的生物反应器；其体内不含有底物三甲基组氨酸(her)、腺苷甲硫氨酸(sam)和半胱氨酸(cys)，但可以利用培养环境中的三甲基组氨酸(her)、腺苷甲硫氨酸(sam)和半胱氨酸(cys)底物，则可作为生产麦角硫因的发酵菌株，将三甲基组氨酸(her)、腺苷甲硫氨酸(sam)和半胱氨酸(cys)底物，结合egt2合成麦角硫因；或者所述底盘菌仅作为重组蛋白的表达菌株，通过诱导蛋白表达获得含有egt29的发酵产物，用以体外制备麦角硫因。

26、本发明提供了所述基因工程菌的构建方法，包括使菌体中表达egt29基因；

27、进一步的，还包括增加yeel基因、mbha基因、yeep基因和ilvg基因的表达，增强伴侣蛋白的表达；

28、进一步的，还包括通过敲除clpb基因，抑制蛋白水解酶的表达；

29、更进一步的，其还包括使egt29基因在菌体中的拷贝数增加。

30、本发明提供的构建方法中，所述egt29基因的过表达、强化伴侣蛋白以及敲除蛋白水解酶的顺序不做限定，实现方式也不做限定，任何能够构建本发明所述基因工程菌的方法都在本发明的保护范围之内。在一些实施例中，通过在ylbe基因位点、trpe基因位点和htga基因位点增加拷贝数对egt29基因进行过表达；通过grna将yeel基因、mbha基因、yeep基因和ilvg基因过表达，来增加伴侣蛋白trigger factor、dnak-dnaj、grpe和groel-groes的表达；通过grna将clpb基因中部分片段切除从而使clpb基因失活，进而抑制蛋白水解酶的表达。

31、本发明提供的构建所述基因工程菌的方法，强化了伴侣蛋白基因的表达，使重组蛋白能够进行有效折叠，形成有催化活性的可溶性蛋白；同时，敲除了蛋白水解酶的clpb基因，抑制蛋白水解酶的表达，减少重组蛋白的降解；利用t7表达系统将目的基因egt29整合到表达宿主基因组的特定位点并增加拷贝数，显著增加了所述基因工程菌表达系统的稳定性，使egt29基因能够高效表达。

32、本发明提供了所述基因工程菌在制备麦角硫因中的应用。

33、本发明还提供了麦角硫因的制备方法，包括发酵培养本发明所述的基因工程菌，或以三甲基组氨酸、腺苷甲硫氨酸和半胱氨酸为底物，以本发明所述基因工程菌的发酵产物结合egt2催化生成麦角硫因。

34、本发明提供的重组菌株，强化了底盘细胞辅助蛋白折叠的伴侣蛋白的表达，能够促进重组蛋白的有效折叠，形成有催化活性的可溶性蛋白；同时还敲除了蛋白水解酶基因，降低了重组蛋白的降解率，利用无质粒的t7表达系统将目的基因egt29整合到大肠杆菌基因组的特定位点，能够显著提高系统的稳定性，克服了游离质粒造成的代谢负担，实现了菌株的高稳定性及高收率、酶的高溶解性及高单位活性。