靶向VEGF途径和PD-1的双特异性抗原结合蛋白、其组合物和用途的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及一种同时靶向vegf途径和pd-1的双特异性抗体、其制备方法、药物组合物和用途。

背景技术：

1、根据世界卫生组织的数据，癌症是全世界一个主要死因，2020年近1000万人死于癌症。已在癌症的早期诊断和正确治疗方面做出了努力，总死亡率与患癌的人数正在减少。

2、癌症实际上是一组涉及异常细胞生长和分裂的疾病。癌细胞非常“聪明”，并且已经发展出几种机制来逃避宿主的免疫监视。例如，它们表达高水平的膜蛋白pd-l1和pd-l2，这两种蛋白与t细胞表面的pd-1结合并诱导t细胞凋亡。癌细胞还分泌血管生成因子，例如血管上皮生长因子(vegf)，以促进新血管长成肿瘤。有了新生成的血管，癌细胞生长得更大更快，因此具有更好的穿梭能力。

3、目前癌症治疗的选择包括手术、放射疗法、化学疗法、激素疗法、靶向疗法、免疫疗法等。其中，抗体疗法发展迅速，近年来取得了相当大的成功。一般来说，抗体可以帮助免疫系统杀死癌细胞、阻止肿瘤血管的发育或直接杀死癌细胞。

4、pd-1，也称为cd279，是一种细胞表面受体。它有两个配体，pd-l1和pd-l2。在响应lps和gm-csf处理时pd-l1在巨噬细胞和树突状细胞上的表达上调，在t细胞受体(tcr)和b细胞受体(bcr)信号传导时pd-l1在t细胞和b细胞上的表达上调，并且在小鼠心脏、肺、胸腺、脾脏和肾脏中可检测到pd-l1 mrna。pd-l1也在肿瘤细胞上表达。pd-l2具有更受限制的表达谱。

5、当与pd-l1或pd-l2结合时，pd-1下调免疫系统并通过抑制t细胞炎症活性来促进自身耐受。pd-1对免疫系统的抑制作用可以预防自身免疫性疾病。另一方面，癌细胞中局部pd-l1表达增加可能会阻止免疫系统杀死这些细胞。几种抗pd-1抗体，如(bms)和(merck)，已被证明可单独或与其他抗肿瘤药物联合用于临床癌症治疗。

6、血管内皮生长因子(vegf)是由细胞产生的信号蛋白，其参与血管生成(vasculogenesis and angiogenesis)。vegf可分为vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d和pigf。vegf过表达可能导致疾病。例如，表达vegf(如vegf-a和vegf-d)的癌症能够在充足的血液供应下生长和转移。vegf-a过度释放被发现在类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、湿型年龄相关性黄斑变性和肾小球肥大中起作用。

7、是一种人源化抗vegf抗体，其已被批准用于治疗各种癌症，包括结肠直肠癌、肺癌和乳腺癌。

8、vegf受体是vegf的天然受体，主要有vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3三个亚型，均具有由7个免疫球蛋白样结构域、跨膜区(a single transmembrane spanning region)和细胞内部分。

9、雷莫芦单抗(ramucirumab)是一种人类igg1单克隆抗体，它阻滞血管内皮生长因子受体2(vegfr-2/vegfr2/kdr)，进而抑制血管生成。fda已批准用于治疗胃癌、肺癌和肝癌。

10、已发现靶向单一肿瘤相关抗原的抗体具有有限的治疗功效。例如，抗vegf抗体被证明在一定程度上抑制癌细胞生长，但不能消除癌细胞。

11、因此，在临床试验和临床治疗中，抗体通常与另一种抗体或另外的治疗剂组合施用，使得靶细胞，例如癌细胞，通过多种方式受到免疫系统的攻击。或者，可以开发具有两种或更多种靶结合特异性的单分子药物，例如双特异性或多特异性抗体/蛋白质，以实现靶向多于一种分子的治疗。目前可用于制备双特异性或多特异性抗体的技术有triomab、crossmab、dvd-ig、bite、dart和tandab等。相同靶点的双特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)之间由于不同的结构及抗体组合等会展现出不同特性。

技术实现思路

1、目前尚未有已上市的靶向vegf途径和pd-1的双特异性抗原结合蛋白相关药物，因此对同靶点药物仍具有一定的需求。

2、本发明的双特异性抗体能够特异性地靶向vegf途径和pd-1，特异地解除pd-1对机体的免疫抑制，同时通过抑制vegf与vegfr结合抑制肿瘤引起的血管发生，具有良好的应用前景。

3、本发明提供了一种双特异性抗原结合蛋白，其包含(a)特异性结合pd-1的第一抗原结合部分；和(b)特异性靶向vegf途径的第二抗原结合部分；并且所述第二抗原结合部分包含vegfr1结构域2或者包含靶向vegfr2的抗体或抗原结合蛋白

4、在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含：重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区从n端到c端依次包含：hcdr1，所述hcdr1具有与seq id no:1列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；hcdr2，所述hcdr2具有与seq id no:2列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和hcdr3，所述hcdr3具有与seq idno:3列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链互补决定区从n端到c端依次包含：lcdr1，所述lcdr1具有与seq idno:4列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；lcdr2，所述lcdr2具有与seq id no:5列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和lcdr3，所述lcdr3具有与seqid no:6列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；

5、所述第二抗原结合部分包含重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区从n端到c端依次包含：hcdr1，所述hcdr1具有与seq id no:7列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；hcdr2，所述hcdr2具有与seq id no:8列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和hcdr3，所述hcdr3具有与seq id no:9列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链互补决定区从n端到c端依次包含：lcdr1，所述lcdr1具有与seq id no:10列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；lcdr2，所述lcdr2具有与seq id no:11列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；和lcdr3，所述lcdr3具有与seq id no:12列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且所述第二抗原结合部分靶向vegfr2；或者

6、所述第二抗原结合部分包含vegfr1结构域2。

7、在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分包含vegfr1结构域2为seq id no:20所述序列。

8、在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分的n端通过第一连接子与所述第一抗原结合部分的重链的c端连接，形成重组的重链(hc)。优选地，所述第一连接子是柔性的。优选地，所述第一连接子是igg4铰链区或(g4s)n，其中n为1-5的整数。

9、在一些实施方案中，其中所述双特异性抗原结合蛋白包含重组的重链(hc)和轻链(lc)，所述重组的重链(hc)包含抗pd1抗体重链、任选的第一连接子、雷莫芦单抗scfv；所述轻链(lc)包含抗pd1抗体轻链。

10、在一些实施方案中，其中所述双特异性抗原结合蛋白包含重组的重链(hc)和轻链(lc)，所述重组的重链(hc)从n端到c端依次包含抗pd1抗体重链可变区vh、igg1重链恒定区、任选的第一连接子、雷莫芦单抗scfv，所述雷莫芦单抗scfv包含雷莫芦单抗重链可变区vh、第二连接子和雷莫芦单抗轻链可变区vl；所述轻链(lc)从n端至c端依次包含抗pd1抗体轻链可变区vl和抗pd1抗体轻链恒定区cl。优选地，所述第二连接子是柔性的。优选地，所述第二连接子可以与所述第一连接子相同或者不同。

11、在一些实施方案中，其中所述双特异性抗原结合蛋白包含重组的重链(hc)和轻链(lc)，所述重组的重链(hc)从n端到c端依次包含抗pd1抗体重链可变区vh、igg1重链恒定区、任选的第一连接子、雷莫芦单抗scfv的重链可变区vh、第二连接子和雷莫芦单抗轻链可变区vl；所述轻链(lc)从n端至c端依次包含抗pd1抗体轻链可变区vl和抗pd1抗体轻链恒定区cl。优选地，所述第二连接子是柔性的。优选地，所述第二连接子可以与所述第一连接子相同或者不同。

12、在一些实施方案中，所述抗pd1抗体重链可变区vh具有与seq id no:16列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述igg1重链恒定区具有与seq id no:17列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述第一连接子是igg4铰链区；(g4s)n，其中n为1-5的整数；所述雷莫芦单抗scfv的重链可变区vh具有与seq id no:18列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述第二连接子是igg4铰链区；(g4s)n，其中n为1-5的整数；优选地，所述第二连接子是(g4s)n，其中n＝3；所述雷莫芦单抗scfv的轻链可变区vl具有与seq id no:19列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述抗pd1抗体轻链可变区vl具有与seq id no:21列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述抗pd1抗体轻链恒定区cl具有与seq id no:22列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

13、在一些实施方案中，所述重组的重链(hc)具有与seq id no:13列出的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列。优选地，所述重组的重链(hc)具有与seq id no:13列出的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

14、在一些实施方案中，所述轻链(lc)具有与seq id no:14列出的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列。优选地，所述轻链(lc)具有与seq id no:14列出的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

15、在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分是雷莫芦单抗scfv，优选地，所述雷莫芦单抗scfv具有与seq id no:25列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

16、在一些实施方案中，所述双特异性抗原结合蛋白由两条seq id no:13和14列出的氨基酸序列组成。

17、在一些实施方案中，所述双特异性抗原结合蛋白包含重组的重链(hc)和轻链(lc)，所述重组的重链(hc)从n端到c端依次包含抗pd1抗体重链可变区vh、igg1重链恒定区、任选的连接子、vegfr1结构域2(r1d2)；所述轻链(lc)从n端至c端依次包含抗pd1轻链抗体可变区vl和轻链恒定区cl。

18、在一些实施方案中，所述抗pd1抗体重链可变区vh具有与seq id no:16列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述igg1重链恒定区具有与seq id no:17列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述第一连接子是igg4铰链区；(g4s)n，其中n为1-5的整数；所述vegfr1结构域2(r1d2)具有与seq id no:20列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述抗pd1轻链抗体可变区vl具有与seq id no:21列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链恒定区cl具有与seq idno:22列出的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

19、在一些实施方案中，所述重组的重链(hc)具有与seq id no:15列出的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列。优选地，所述重组的重链(hc)具有与seq id no:15列出的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

20、在一些实施方案中，所述轻链(lc)具有与seq id no:14列出的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列。优选地，所述轻链(lc)具有与seq id no:14列出的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

21、在一些实施方案中，所述双特异性抗原结合蛋白由seq id no:15和14列出的氨基酸序列组成。

22、在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分是vegfr1结构域2(r1d2)。本发明还提供了编码根据前述双特异性抗原结合蛋白的核酸序列。

23、在一些实施方案中，所述hc包括以下突变：l234a、l235a、d265a、p329a。

24、本发明还提供了质粒或载体，所述质粒或载体包含编码上述双特异性抗原结合蛋白的核酸序列，或者包含上述核酸序列。

25、本发明还提供了包含并表达上述核酸序列、质粒或载体的宿主细胞。

26、本发明还提供了包含根据上述双特异性抗原结合蛋白的组合物。

27、本发明还涉及上述双特异性抗原结合蛋白或组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

28、本发明还提供了一种治疗癌症的方法，包括向有相应需要的受试者施用上述双特异性抗原结合蛋白或组合物。

29、在一些实施方案中，可以使用本发明的双特异性抗原结合蛋白或包含其的组合物抑制其生长的优选癌症包括通常对免疫治疗有响应的癌症。用于治疗的优选的癌症的非限制性实例包括肺癌、淋巴瘤、间皮瘤、黑色素瘤和肾细胞癌。此外，本发明还包括可以使用本发明的双特异性抗原结合蛋白或包含其的组合物抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。

30、可以使用本发明的双特异性抗原结合蛋白或包含其的组合物治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病；儿童实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，特别是表达pd-l1的转移性癌症(iwai等(2005)int.immunol.17:133-144)。

31、本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和示例中变得明显，或者通过实施本技术而了解，以下详细描述和示例不应被解释为限制性的。本技术的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。本技术全文引用的所有参考文献、genbank条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确并入本文。