包含多亚基细胞因子的双细胞因子融合蛋白的制作方法

本发明涉及生物，更具体地说，涉及一种新型双细胞因子融合蛋白，其包含白介素-12(“il-12”)或白介素-il-27与其他炎性和免疫调节性细胞因子的组合；涉及治疗炎性和免疫疾病或病症的方法、和/或治疗癌症的方法。

背景技术：

1、il-12是一种70kda异二聚体细胞因子，是原型t辅助细胞1型(th1)极化细胞因子(mossman,1989；athie-morales,2004)。il-12通过激活cd8+t细胞(henry,2008；vacaflores,2017；chowdhury,2011)、nk细胞(2015；parihar,2002；zhang,2008)、cd4+t细胞(yoo,2002；vacaflores1,2016)以及一定程度上，单核细胞(coma,2006)，来发挥强的抗肿瘤免疫。因此，il-12主要增强抗原特异性t细胞活化，同时可通过适度刺激nk细胞和单核细胞，部分地桥接先天免疫系统。

2、干扰素-α(ifnα-2a)是i型干扰素单体，可直接诱导树突状细胞成熟(simmons,2012；gessani,2014；padovan,2002)并增强cd8+t细胞的细胞毒性功能(hiroishi,2000；kolumam,2005；lu,2019)。因此，相对于其在适应性免疫反应上具有的更有限影响，ifnα-2a对先天免疫系统的作用更大。

3、il-12的抗肿瘤作用已在临床前和临床上进行评估(brunda，1993；atkins，1997)，其中由于毒性，直接肿瘤内注射被评估并发现优于临床给药(herpen，2004；li s.，2005；sabel，2004)。

4、类似地，ifnα-2a已在临床前评估，并以聚乙二醇化形式进行了临床评估(lyrdal，2009；sunela，2009；medrano，2017)，被批准用于某些癌症(how，2020)。

5、考虑到为驱动强健的抗肿瘤功能既需要启动抗肿瘤免疫反应(nemunaitis,2005)又需要刺激cd8+、cd4+和nk细胞，本发明人发现，将ifnα-2a和il-12组合在靶向型双细胞因子支架系统上(称为“diakinetm，(“dk”)，其在共同待决申请美国申请号17/110,104中进行了一般性描述)，以使这两种细胞因子靶向肿瘤微环境，可以通过诱导m2单核细胞分化为功能性抗原呈递细胞(vidyarthi,2018)来增强原位启动，并增强t细胞和nk细胞功能。这两种细胞因子的组合在适应性免疫系统和先天免疫系统之间架起了刺激的桥梁。

6、白介素10(il-10)是一种非共价同二聚体细胞因子，其结构与干扰素g(ifng)相似。il-10受体由两个il10受体1(il10r1)分子和两个il-10受体2(il10r2)分子组成(moore，2001)。il-10受体在大多数造血细胞表面表达，并在巨噬细胞和t细胞上高度表达。

7、据报道，il-10既是免抑制性细胞因子(schreiber,2000)，又是免疫刺激性细胞因子(mumm,2011)。但il-10治疗克罗恩病患者的临床评估结果显示反向剂量反应(fedorak,2000；schreiber,2000)，而用聚乙二醇化il-10治疗癌症患者则产生了剂量可滴定的强效抗肿瘤反应(naing,2018)。

8、据报道，il-10可抑制由il-2驱动的ifng自nk和cd4+t细胞的分泌产生(scott,2006)，但也有报道称，il-10可以用作il-2诱导的cd8+t细胞增殖的辅助因子(groux,1998)。

9、本发明人还发现，将il-10和il-12组合在靶向型dk细胞因子支架系统上从而使这两种细胞因子靶向肿瘤微环境，可增强nk和t细胞功能。

10、il-27是il-12家族成员，是一种由两个亚基(p28和eb病毒诱导基因3(“eib3”))组成的异二聚体细胞因子。已知il-27可诱导il-10。il-28是一种3型干扰素，可引发ifnα-2a释放，刺激cd8+t细胞。il-28包括两种同种型，il-28a和il-28b。il-29与il-28具有序列同源性，也是一种参与先天性和适应性免疫反应的3型干扰素。

11、本发明人还发现，其他细胞因子组合(包括但不限于il-12与白介素28(il-28)或白介素29(il-29)的组合、白介素27(il-27)与ifnα-2a、il-28或il-29的组合)可并入本文描述的双细胞因子支架系统中(参见例如图1)。简而言之，双细胞因子支架系统允许多亚基细胞因子(例如，包括但不限于il-12，il-27)融合到包含人抗hiv或人抗埃博拉单克隆抗体的抗原结合结构域或单链可变区(scfv)的支架系统的末端，与第二细胞因子(例如，il-2，il-4，ifna-2a，il-10)组合，其中第二细胞因子融合在所述抗原结合结构域或scfv的铰链区中。

12、本发明人还发现，双细胞因子支架系统允许多亚基细胞因子(例如，il-12、il-27)融合到包含人抗hiv或人抗埃博拉单克隆抗体的抗原结合结构域或scfv的支架系统的末端，与单体细胞因子(例如，ifn-α、il-28、il-29)或另一多亚基细胞因子(例如，il-10、il-12、il-27)组合。

13、如先前在美国专利10,858,412中所描述，包含非免疫原性可变重链(“vh”)和可变轻链(“vl”)区的支架系统，导致产生半衰期延长的、正确折叠并保持功能活性的il-10变体分子。将il-10整合到该支架系统中，显示了增强的il-10对炎症细胞(例如单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞)和免疫细胞(例如cd8+t细胞)的功能。参见美国专利10,858,412；于2020年3月6日提交，作为美国申请16/811,718，全文以引用方式并入本文。本技术在早期发现的基于il-10的双细胞因子支架系统上提出了改进，用其他多亚基细胞因子(例如il-12、il-27等)代替il-10，并进一步将第二细胞因子整合到该新型融合蛋白中，以加性或协同的方式增强所述多亚基细胞因子(例如il-12或il-27)的生物学特性，从而治疗炎性疾病、免疫疾病和/或癌症。

技术实现思路

0、发明概述

1、本公开内容一般地涉及双细胞因子融合蛋白。

2、因此，在第一方面，本公开内容涉及双细胞因子融合蛋白，其包含第一细胞因子和第二细胞因子，所述第一细胞因子是多亚基细胞因子，例如但不限于il-10、il-12或il-27及其变体，其中每个亚基分别与获自单克隆抗体的scfv或抗原结合片段的可变重链(“vh”)或可变轻链(“vl”)区融合，其中所述第二细胞因子连接在所述scfv或抗原结合片段的vh和vl区之间。在某些实施方案中，第一细胞因子可以是任何多亚基细胞因子，例如但不限于，il-10、il-12或il-27、或其功能变体，其中所述变体包括一个或多个氨基酸取代，以增强il-10、il-12或il-27的功能。所述融合蛋白还包括第二细胞因子，其是与所述多亚基细胞因子(例如il-10、il-12或il-27)协同发挥作用的细胞因子，由此当第一和第二细胞因子通过scfv或抗原结合片段的vh和vl区靶向特定抗原时，产生加性或协同效应。这些第二细胞因子可以是任何细胞因子，包括但不限于il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-10、il-15、il-21、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13。双细胞因子融合蛋白还可以包括用来自任何靶向抗体的cdr植入或替换所述scfv的互补决定区(“cdr”)，所述靶向抗体将双细胞因子融合蛋白引导至靶抗原。

3、在又一方面，本公开内容涉及式(ia)或(ib)的双细胞因子融合蛋白：

4、nh2-(r1)-(x1)-(zn)-(x2)-(r2)-cooh(式ia)；

5、nh2-(r2)-(x1)-(zn)-(x2)-(r1)-cooh(式ib)；

6、其中

7、“r1”是来自任何多亚基第一细胞因子的α亚基，优选为il-12-α亚基(p35)或il-27α亚基(p28)，更优选为seq id no:1或5或17或19的亚基；

8、“r2”是来自任何多亚基第一细胞因子的β亚基，优选为il-12-β亚基(p40)或il-27β亚基(ebi3)，更优选为seq id no:3或7或18或20的亚基；

9、其中当r1是第一细胞因子的α亚基时，r2是第一细胞因子的β亚基；或者当r1是p35时，r2是p40；或者当r1是p28时，r2是ebi3；或者当r1为seq id no:1、17或19时，r2为seq idno:3、18或20；或者当r1为seq id no:5时，r2为seq id no:7；

10、“x1”为从第一单克隆抗体获得的vl或vh区；“x2”为从第一单克隆抗体获得的vh或vl区；其中当x1为vl时，x2为vh，或者当x1为vh时，x2为vl；

11、“z”为任何能够增强所述多亚基细胞因子的生物学功能的细胞因子，优选ifnα-2a、il-28、il-29；并且

12、“n”为选自0-2的整数。

13、在一个实施方案中，所述vh和vl为获自人抗埃博拉抗体的scfv的形式。在另一实施方案中，从人抗埃博拉抗体获得的scfv的6个cdr(来自vh的cdr 1-3和来自vl的cdr 1-3)被替换或移植成来自第二单克隆抗体的6个cdr，由此使得所述双细胞因子融合蛋白能够靶向特定靶标，例如但不限于酶、受体、细胞外蛋白或细胞内蛋白，例如与肿瘤(例如肿瘤相关抗原(taa))、炎症反应或自身免疫性疾病相关的靶标。第二抗体可以包括但不限于，表皮生长因子受体(egfr)；cd14；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd19；cd20；cd22；cd47；cd123；gd-2；vegfr1；vegfr2；her2；pdgfr；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素；bcma；psa；psma；cea；gpc3；sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；或sr-j1。

14、在又一个方面，本公开内容涉及包含il-12的双细胞因子融合蛋白，所述融合蛋白为式(iia)或(iib):

15、nh2-(p35)-(l)-(x1)-(l)-(zn)-(l)-(x2)-(l)-(p40)-cooh(式iia)；

16、nh2-(p40)-(l)-(x1)-(l)-(zn)-(l)-(x2)-(l)-(p35)-cooh(式iib)；

17、其中

18、“p35”是具有seq id no:1、17或19序列的il-12α亚基；

19、“p40”是具有seq id no:3、18或20序列的il-12β亚基；

20、“l”是任意接头；

21、“x1”为从第一单克隆抗体获得的vl或vh区；“x2”为从第一单克隆抗体获得的vh或vl区；其中当x1为vl时，x2为vh，或者当x1为vh时，x2为vl；

22、“z”是选自il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-10单体、il-15、il-21、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β、或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13的细胞因子；且

23、“n”为选自0-2的整数。

24、在一个实施方案中，vh和vl是从人抗埃博拉抗体获得的scfv的形式。在另一实施方案中，从人抗埃博拉抗体获得的scfv的6个cdr(来自vh的cdr 1-3和来自vl的cdr 1-3)被替换或移植为来自第二单克隆抗体的6个cdr，这使得双细胞因子融合蛋白能够针对特定靶标，例如但不限于酶、受体、细胞外蛋白或细胞内蛋白，例如与肿瘤(例如肿瘤相关抗原(taa))、炎症反应或自身免疫性疾病相关的靶标。第二抗体可以包括但不限于表皮生长因子受体(egfr)；cd14；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd19；cd20；cd22；cd47；cd123；gd-2；vegfr1；vegfr2；her2；pdgfr；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素；bcma；psa；psma；cea；gpc3；sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；或sr-j1。

25、在又一个方面，本公开内容涉及包含il-27的双细胞因子融合蛋白，所述融合蛋白为式(iiia)或(iiib):

26、nh2-(p28)-(l)-(x1)-(l)-(zn)-(l)-(x2)-(l)-(ebi3)-cooh(式iiia)；

27、nh2-(ebi3)-(l)-(x1)-(l)-(zn)-(l)-(x2)-(l)-(p28)-cooh(式iiib)；

28、其中

29、“p28”是具有seq id no；5序列的il-27的α亚基；

30、“ebi3”是具有seq id no；7序列的il-27的β亚基；

31、“l”是任意接头；

32、“x1”为从第一单克隆抗体获得的vl或vh区；“x2”为从第一单克隆抗体获得的vh或vl区；其中当x1为vl时，x2为vh，或者当x1为vh时，x2为vl；

33、“z”是选自il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-10单体、il-15、il-21、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β、或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13的细胞因子；

34、“n”为选自0-2的整数。

35、在一个实施方案中，vh和vl是从人抗埃博拉抗体获得的scfv的形式。在另一实施方案中，从人抗埃博拉抗体获得的scfv的6个cdr(来自vh的cdr 1-3和来自vl的cdr 1-3)被替换或移植为来自第二单克隆抗体的6个cdr，这使得双细胞因子融合蛋白能够针对特定靶标，例如但不限于酶、受体、细胞外蛋白或细胞内蛋白，例如与肿瘤(例如肿瘤相关抗原(taa))、炎症反应或自身免疫性疾病相关的靶标。第二抗体可以包括但不限于表皮生长因子受体(egfr)；cd14；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd19；cd20；cd22；cd47；cd123；gd-2；vegfr1；vegfr2；her2；pdgfr；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素；bcma；psa；psma；cea；gpc3；sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；或sr-j1。

36、在又一个方面，本公开内容涉及包含两个多亚基蛋白的双细胞因子融合蛋白，所述融合蛋白为式(iv):

37、nh2-(r1)-(la)-(x1)-(la)-(w1)-(lb)-(w2)-(la)-(x2)-(la)-(r2)-cooh(式iv)；

38、其中

39、“r1”是第一细胞因子(例如il-12或il-27)的α亚基或同二聚细胞因子(例如il-10)的第一单体，其中r1优选为p40；

40、“r2”是第一细胞因子(例如il-12或il-27)的β亚基或同二聚细胞因子(例如il-10)的第二单体，其中r2优选为p35；

41、“la”是任何接头；优选为seq id no.:45的(ggggs)4，或seq id no.:44的(ggggs)5；

42、“lb”是任何接头；优选为seq id no.:43的gggsggg或seq id no.:46的(ggggs)3；

43、“x1”为从第一单克隆抗体获得的vl或vh区；“x2”为从第一单克隆抗体获得的vh或vl区；其中当x1为vl时，x2为vh，或者当x1为vh时，x2为vl；

44、“w1”是第一细胞因子(例如il-12或il-27)的α亚基或同二聚细胞因子(例如il-10)的第一单体，优选il-10的第一单体；

45、“w2”是第一细胞因子(例如il-12或il-27)的β亚基或同二聚细胞因子(例如il-10)的第二单体，优选il-10的第二单体。

46、在一个实施方案中，vh和vl为从人抗埃博拉抗体获得的scfv形式。在另一实施方案中，从人抗埃博拉抗体获得的scfv的6个cdr(来自vh的cdr 1-3和来自vl的cdr 1-3)被替换或移植为来自第二单克隆抗体的6个cdr，这使得双细胞因子融合蛋白能够针对特定靶标，例如但不限于酶、受体、细胞外蛋白或细胞内蛋白，例如与肿瘤(例如肿瘤相关抗原(taa))、炎症反应或自身免疫性疾病相关的靶标。第二抗体可以包括但不限于表皮生长因子受体(egfr)；cd14；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd19；cd20；cd22；cd47；cd123；gd-2；vegfr1；vegfr2；her2；pdgfr；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素；bcma；psa；psma；cea；gpc3；sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；或sr-j1。

47、在又一个方面，本公开内容涉及包含两个多亚基蛋白的双细胞因子融合蛋白，所述融合蛋白为式(v)：

48、nh2-(p35)-(la)-(x1)-(la)-(il10单体)-(lb)-(il10单体)-(la)-(x2)-(la)-(p40)-cooh(式va)；

49、nh2-(p40)-(la)-(x1)-(la)-(il10单体)-(lb)-(il10单体)-(la)-(x2)-(la)-(p35)-cooh(式vb)；

50、其中

51、“p35”是具有序列seq id no:1、17或19的il-12的α亚基；

52、“p40”是具有序列seq id no:3、18或20的il-12的βα亚基；

53、“la”是任何接头；优选seq id no.:45的(ggggs)4，或seq id no.:44的(ggggs)5；

54、“lb”是任何接头；优选seq id no.:43的gggsggg或seq id no.:46的(ggggs)3；

55、“x1”为从第一单克隆抗体获得的vl或vh区；“x2”为从第一单克隆抗体获得的vh或vl区；其中当x1为vl时，x2为vh，或者当x1为vh时，x2为vl；

56、“il10单体”是具有seq id no:1、3、5、7、14或16序列的il-10单体，优选seq id no:16。

57、在一个实施方案中，vh和vl为从人抗埃博拉抗体获得的scfv的形式。在另一个实施方案中，从人抗埃博拉抗体获得的scfv的6个cdr(来自vh的cdr 1-3和来自vl的cdr 1-3)被替换或移植为来自第二单克隆抗体的6个cdr，这使得双细胞因子融合蛋白能够针对特定靶标，例如但不限于酶、受体、细胞外蛋白或细胞内蛋白，例如与肿瘤(例如肿瘤相关抗原(taa))、炎症反应或自身免疫性疾病相关的那些靶标。第二抗体可以包括但不限于egfr；cd14；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd19；cd20；cd22；cd47；cd123；gd-2；vegfr1；vegfr2；her2；pdgfr；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素；bcma；psa；psma；cea；gpc3；sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；或sr-j1。

58、在其他方面，本公开涉及编码多亚基双细胞因子融合蛋白的核酸分子。包括编码由式(ia)、(ib)、(iia)、(iib)、(iiia)、(iiib)、(iv)、(va)和(vb)表示的双细胞因子融合蛋白的核酸分子。

59、在其他方面，本公开涉及制备和纯化双细胞因子融合蛋白的方法。在一个实施方案中，制备双细胞因子融合蛋白的方法包括重组表达编码所述双细胞因子融合蛋白的核酸。

60、在其他方面，本公开涉及一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的双细胞因子融合蛋白。

61、在其他方面，本公开涉及一种治疗炎性疾病或病症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的双细胞因子融合蛋白。优选地，所述炎性疾病是克罗恩病、银屑病和/或类风湿性关节炎。

62、在其他方面，本公开涉及一种治疗免疫疾病或病症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的双细胞因子融合蛋白。

63、在其他方面，本公开涉及治疗、抑制和/或缓解脓毒症和/或脓毒症休克及其相关症状的方法。

64、以上对代表性方面的简化总结旨在提供对本公开的基本理解。本总结并非对所有考虑方面的全面概述，并非旨在确定所有方面的关键或重要要素，也并非旨在界定本公开的任何或所有方面的范围。其唯一目的是以概述方式呈现一个或多个方面，作为随后更详细描述本公开的序言。为实现上述目标，本公开的该一个或多个方面包括权利要求中描述和示例性指出的特征。