水稻CSK1蛋白在调控水稻次生壁形成中的应用

本发明属于生物，具体为水稻csk1蛋白在调控水稻次生壁形成中的应用。

背景技术：

1、次生壁主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，是地球上最丰富的可再生资源，同时也是构筑植物体的物质基础。次生壁的形成与众多的生理生化过程密切相关，对粮食作物水稻而言，次生壁对水稻的支撑力、株型、环境适应性等农艺性状的塑造起着关键作用，进而影响水稻的产量，因而揭示次生壁的有序合成与沉积的调控机制至关重要。研究表明来自于内外源的信号如植物激素、小肽、寡糖片段、活性氧、光、缺水胁迫等均参与调控次生壁的形成。类受体激酶通常起着感知信号和传递信号的作用，但参与次生壁形成调控通路的类受体激酶还很少报道。而大量的遗传学研究发现了参与次生壁形成调控的一系列关键转录因子，但它们大多为开-关型控制因子，如拟南芥中vnd类转录因子调控导管细胞的次生壁的合成，snd1、nst类转录因子调控束间纤维和木质部纤维细胞次生壁合成。而次生壁形成的精细调节元件鲜有报道，尤其是重要的粮食作物水稻中相关的报道还比较空白。而微调节作用往往在作物性状设计改良中更具有利用价值。因此，解析水稻次生壁形成调控通路的分子机制对于水稻农艺性状的改良和环境适应性具有重要的意义，可以为培育抗倒伏抗逆的分子设计育种提供分子靶标。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的次生壁形成能力。

2、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物次生壁形成中的应用。

3、本发明提供的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：

4、1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物次生壁形成中的应用；

5、2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物次生壁形成的产品中的应用；

6、3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育次生壁形成改变的植物中的应用；

7、4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育次生壁形成改变的植物的产品中的应用；

8、5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；

9、所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：

10、a1)氨基酸序列为seq id no.3的蛋白质；

11、a2)将seq id no.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

12、a3)a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

13、a4)a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

14、上述a1)所述蛋白质的名称为csk1。

15、为了使a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

16、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

17、所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。

18、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质csk1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质csk1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质csk1且具有蛋白质csk1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

19、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

20、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

21、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

22、本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

23、上述应用中，所述蛋白质来源于水稻(oryza sativa l.)。

24、本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质csk1。

25、上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

26、本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。

27、上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与前文所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

28、c1)编码前文所述蛋白的核酸分子；

29、c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

30、c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

31、c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；

32、c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

33、c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；

34、c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；

35、e1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；

36、e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；

37、e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；

38、e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；

39、e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

40、e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；

41、e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。

42、上述应用中，c1)所述核酸分子可为如下任一所示的dna分子，

43、d1)核苷酸序列是seq id no.1所示的dna分子；

44、d2)编码区序列是序列表中seq id no.1所示的dna分子；

45、d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码前文所述蛋白的dna分子；

46、d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述蛋白的dna分子。

47、上述应用中，e1)所述的核酸分子可为包含能够表达靶向敲除前文所述蛋白编码基因的grna对应的dna分子或为靶向前文所述蛋白编码基因的grna。

48、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

49、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pylcrispr/cas9pubi-h载体。

50、可用现有的植物表达载体构建含有csk1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

51、使用csk1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

52、为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

53、利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的csk1基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得次生壁形成改变的转基因细胞系及转基因植株。携带csk1基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

54、本发明还提供了一种提高植物次生壁形成的方法，所述方法包括步骤p，所述步骤p为抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默前文所述蛋白的编码基因的表达量，来提高植物次生壁形成。

55、本发明还提供了一种降低植物次生壁形成的方法，所述方法包括步骤m，所述步骤m为增强、提高或上调目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调前文所述蛋白的编码基因的表达量，来降低植物次生壁形成。

56、上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质csk1的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质csk1的编码基因活性下降或失活。

57、本发明提供一种培育次生壁形成能力提高的植物的方法，包括敲除或抑制或降低或沉默目的植物中上述蛋白的编码基因的表达和/或上述蛋白的含量和/或活性，或/和敲除或抑制或降低或沉默上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到次生壁形成能力提高的植物。

58、在本发明的一个实施方案中，所述培育次生壁形成能力提高的植物的育种方法包括如下步骤：

59、(1)构建敲除或抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；

60、(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或水稻)中，获得次生壁形成能力高于所述受体植物的植物。

61、本发明中，所述植物育种的目的可包括培育次生壁形成能力提高的植物。

62、上述应用或方法中，所述植物可为下述任一种植物：

63、n1)单子叶植物或双子叶植物，

64、n2)禾本目植物，

65、n3)禾本科科植物，

66、n4)稻属植物，

67、n5)水稻。

68、本研究通过对次生壁cesa进行共表达分析和水稻幼嫩节间转录组分析遴选到参与调控次生壁纤维素形成的类受体激酶csk1，揭示其通过磷酸化nac类转录因子vnd6负调控水稻次生壁纤维素形成的调控通路，并且csk1响应aba信号，受到转录因子abl1的直接调控，其突变体在aba处理下细胞伸长受到抑制，表明csk1能够协调次生壁形成和细胞伸长，这些发现为培育抗倒伏和抗逆的优质水稻品种提供基因资源。