非人灵长类动物类囊胚的建立及其应用

本发明属于发育生物学及动物模型领域，更具体地，本发明涉及非人灵长类动物类囊胚的建立及其应用。

背景技术：

1、由于有限的样本可用性和伦理限制，人类胚胎发育和器官发生的分子机制在很大程度上仍然不清楚。基于自组装和分化能力，多能干细胞(pluripotent stem cells，pscs)可以在特定条件下被诱导形成胚胎样结构(包括类囊胚、拟胚体和类原肠胚)，为体外研究胚胎发育提供了一个有用的工具。

2、基于胚胎干细胞(embeyonic stem cells，escs)和滋养层干细胞(trophoblaststemcells，tscs)，或扩展多能干细胞(extended pluripotent stem cells，epscs)建立的小鼠类囊胚，已被证明具有形成包含胚胎-胚胎外轴的胚胎样结构的潜能。另一种小鼠胚胎模型来源于胚胎干细胞(escs)、滋养层干细胞(tscs)和胚胎外内胚层干细胞(extraembryonic endoderm stem cells，xen)，可以通过体外培养系统部分模拟原肠胚后的着床后胚胎发育过程。然而胚胎发育过程在啮齿类动物和灵长类动物之间的差异还是很大的。

3、最近，在特定的诱导方案下，使用人类naive escs或epscs成功生成了与囊胚相似形态和转录组的人的类囊胚，为体外研究人类囊胚的发育提供了一个可靠的模型。然而，目前评估人类囊胚的体内或体外发育潜能的体外长期培养和体内移植仍然无法进行，无法进展到原肠胚以及之后的发育阶段进行研究。

4、因此，本领域迫切需要一种包含物种间差异、样本限制和伦理考虑的新的囊胚发育模型。尽管可以将目光转移到常被认为与人接近的猴类动物，但鉴于物种上仍然具有差异，套用人类囊胚诱导方案时，本领域仍然无法实现良好的制备，亟待找到合适的、优化的建立方法和体系。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种非人灵长类动物类囊胚的建立及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种建立非人灵长类动物类囊胚的方法，包括：

3、(1)以非人灵长类动物的始发态胚胎干细胞(primed escs)为出发细胞，通过4cl培养基(4cl系统)将之转化为原始态胚胎干细胞(naive escs)；

4、(2)(1)获得的细胞在胚外内胚层细胞分化培养基(hdm)诱导1-3天；

5、(3)(2)获得的细胞以mtdm诱导3-9天，获得非人灵长类动物的类囊胚；其中，所述mtdm为基于人的滋养层细胞分化培养基(tdm)优化的培养基，其中包括添加na-pyruvate，iwr-1，tsa，dznep，activin a和geltrex。

6、在一种或多种优选实施方式中，所述mtdm中不存在sb590885，wh-4-023，im-12。

7、在一种或多种优选实施方式中，步骤(3)中，所述组分：

8、na-pyruvate：0.1～1x；

9、iwr-1：1～8μm；

10、tsa：1～8μm；

11、dznep：2～15nm；

12、activin a：4～20ng/ml；

13、geltrex：0.03～0.5％(v/v)；

14、较佳地，mtdm中含有抗坏血酸：10～50μg/ml。

15、在一种或多种优选实施方式中，步骤(1)的时间为0.5-2天(如1±0.5天)。

16、在一种或多种优选实施方式中，步骤(2)中，胚外内胚层细胞分化培养基(hdm)诱导1.5-2.5天，较佳地1.8-2.2天(如2天)。

17、在一种或多种优选实施方式中，步骤(3)中，mtdm诱导4-8天，较佳地4.5-7天(如5-6天)。

18、在一种或多种优选实施方式中，所述非人灵长类动物类囊胚具有选自下组的性能：包含oct4/nanog+的icm细胞，gata6/gata4+的胚外下胚层细胞，gata3/cdx2+的滋养层细胞；表达zo1；具有自然囊胚的主要谱系和相应的转录组特征；具有体外分离囊胚三个谱系样干细胞的能力；较佳地，所述谱系样干细胞包括：原始态胚胎干细胞(naive escs)、滋养层干细胞(tscs)、原始胚胎外内胚层(nends)；能够经由体外延迟培养进一步发育到着床后阶段，其形态和结构呈现原肠形成期的形态与结构；在着床后和原肠形成阶段具有进一步发育的潜力；能够启动与造血相关的最早的谱系分化；体外培养的胚胎发育特征上具有人的胚胎的发育特征；或，体内移植后能引起早期妊娠反应。

19、在本发明的另一方面，提供一种制备体外非人灵长类动物原肠胚的方法，包括：

20、(a)以前面任一所述的方法建立非人灵长类动物类囊胚；

21、(b)对(a)的方法进行体外延迟培养；较佳地，所述体外延迟培养包括：人工分离所述类囊胚(较佳地还包括洗涤)，依次利用ivc-1培养基(较佳地1±0.5天)和ivc-2培养基(较佳地每1-3天更换新鲜培养基)进行培养。

22、在一种或多种优选实施方式中，所述4cl培养基、hdm培养基、tdm培养基、ivc-1培养基、ivc-2培养基的配方见实施例中所述，其各个培养基的组分范围可上下浮动0.5-60％，较佳地1-55％，较佳地2-50％，进一步如3％、5％、8％、10％、15％、20％、30％、40％、45％等。

23、在一种或多种优选实施方式中，(b)所述体外延迟培养的时间为7-13天(较佳地8-12天，更佳地9-11天，如10天)，所述非人灵长类动物囊胚形成胚盘样结构，包括绒毛膜以及绒毛膜腔，羊膜腔，卵黄囊腔，原条，a-p轴等，发展为三个胚层(包括内胚层、中胚层、外胚层)，启动原肠形成。

24、在一种或多种优选实施方式中，进行体外延迟培养，使得囊胚重建原肠形成周围的谱系规范，形成包括(但不限于)以下的与体内胚胎共同的主要谱系：epi、胚胎外间充质细胞(exmc)、羊膜上皮(ame)、gast和te，以及pgc和ve/ye；较佳地，体外培养的类囊胚能启动与造血相关的最早的谱系分化。

25、在一种或多种优选实施方式中，进行体外延迟培养，启动内胚层、中胚层和外胚层的三胚层的分化。

26、在本发明的另一方面，提供一种使得非人灵长类动物发生妊娠(启动早期妊娠)的方法，包括：

27、(i)以前面任一所述的方法建立非人灵长类动物类囊胚；

28、(ii)将(i)的非人灵长类动物类囊胚移植到同种非人灵长类动物代孕母体的子宫内。

29、在一种或多种优选实施方式中，所述的非人灵长类动物包括(但不限于)选自下组的动物：猴；较佳地，所述的猴包括选自下组的猴：食蟹猴、恒河猴、猕猴、绿猴、绒猴、松鼠猴。

30、在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法的应用，用于建立非人灵长类动物类囊胚。

31、在一种或多种优选实施方式中，所述非人灵长类动物类囊胚用于进行体外延迟培养，或用于制备体外延迟培养及胚胎发育/分化的研究模型(囊胚发育模型)；

32、在一种或多种优选实施方式中，所述非人灵长类动物类囊胚用于进行人工受孕研究，或用于制备进行人工受孕研究的研究模型(囊胚模型)。

33、在一种或多种实施方式中，所述的各个方法或应用为非治疗性的方法或应用，不以疾病的治疗为直接目的。

34、在本发明的另一方面，提供一种非人灵长类动物类囊胚模型，其存在于体外且不发育为动物体，其由前面任一所述的方法制备获得。

35、在本发明的另一方面，提供所述的非人灵长类动物类囊胚模型的应用，用于：(a)进行体外延迟培养，或制备体外延迟培养及胚胎分化的研究模型(囊胚发育模型)；或(b)进行人工受孕研究，或制备进行人工受孕研究的研究模型(囊胚模型)；较佳地，(a)或(b)的模型进一步用于作为筛选调控动物胚胎发育能力或受孕能力的候选药物的模型。

36、在本发明的另一方面，提供一种用于制备非人灵长类动物类囊胚模型的试剂盒，其中包括：

37、(1)4cl培养基(4cl系统)；

38、(2)胚外内胚层细胞分化培养基(hdm)；

39、(3)mtdm，其为基于人的滋养层细胞分化培养基(tdm)优化的培养基。

40、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。