一种肿瘤微环境调控复合基因载体及其制备方法和应用

本发明属于生物医用有机高分子材料，具体涉及一种肿瘤微环境调控复合基因载体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、基因疗法以其针对肿瘤发生机制的精准性和个性化特点，成为探索新型高效治疗策略的重要方向。然而，现有技术中临床实体瘤的基因治疗并未达到预期的理想效果，其主要原因是治疗过程中肿瘤微环境功能失调，甚至被驯化为促肿瘤的帮凶，极大地削弱了抗实体瘤疗效。具体地，肿瘤微环境中的巨噬细胞通过向实体肿瘤募集外周血单核细胞并分化为肿瘤相关巨噬细胞（tam），tam具有高度可塑性，会根据微环境信号的变化从一种表型转换到另一种表型（m1↔m2）。其中，m1样表型巨噬细胞具有抗肿瘤作用，但会被肿瘤微环境中的th2细胞“教育”成促肿瘤的m2样表型；m2不仅具有促进肿瘤血管生成、肿瘤干性保持的功能，而且还是形成免疫抑制性微环境的主要帮凶，推动肿瘤的侵袭和转移。

2、基因疗法需要依靠基因载体，而与病毒基因载体相比，非病毒基因载体具有免疫原性更低、基因载荷能力更高、安全性更高、制备方法更简单等特点。但非病毒基因载体中的裸质粒（pdna）易被细胞外基质中的核酸酶迅速降解，药代动力学性质差，很难穿过细胞膜，因此，需要载体系统将pdna递送至靶细胞。目前，已经报道的非病毒载体（包括：脂质体、聚乙烯亚胺、玉米蛋白、壳聚糖和硅酸盐等），存在转染效率和靶细胞选择性较低的问题，从而导致临床实体瘤的基因治疗效果不理想。

技术实现思路

1、本发明为解决现有技术中的非病毒基因载体存在转染效率和靶细胞选择性较低的技术问题，提供了一种肿瘤微环境调控复合基因载体及其制备方法和应用。

2、本发明的目的之一在于提供一种肿瘤微环境调控复合基因载体，所述肿瘤微环境调控复合基因载体包括以下成分：巨噬细胞极化剂blz945、丝素蛋白、聚乙烯亚胺和表达肿瘤抑制基因的pdna。

3、在本发明的一个优选实施例中，所述pdna表达的肿瘤抑制基因为p53基因、生长抑制因子4、白细胞介素家族基因、肿瘤坏死因子-α、多肿瘤抑制基因p16、腺瘤性息肉病基因或视网膜细胞瘤基因rb中的一种或两种。

4、在本发明的一个优选实施例中，所述丝素蛋白包括家蚕丝素蛋白或柞蚕丝素蛋白，所述聚乙烯亚胺的分子量＜2500 da。

5、在本发明的一个优选实施例中，所述复合基因载体的包装形式为共混包装或层层包装。

6、在本发明的一个优选实施例中，所述共混包装形式的复合基因载体的制备方法包括以下步骤：

7、s1：将巨噬细胞极化剂blz945溶解至无水二甲基甲酰胺中，再加入丝素蛋白溶液，置于冰浴中搅拌12-20 h，在0-4℃、8000-10000 rpm条件下离心超滤30-45 min，获得极化剂修饰后的丝素蛋白溶液；

8、s2：将s1中获得的极化剂修饰后的丝素蛋白溶液与聚乙烯亚胺溶液混合，涡旋5-10 min，再经0.22 μm滤嘴过滤，获得丝素蛋白和聚乙烯亚胺混合物；向上述混合物中加入pdna溶液，涡旋60 s，在0-4℃条件下静置30-45 min，获得共混包装形式的pdna复合基因载体。

9、在本发明的一个优选实施例中，所述层层包装形式的复合基因载体的制备方法包括以下步骤：

10、s11：将巨噬细胞极化剂blz945溶解至无水二甲基甲酰胺中，再加入丝素蛋白溶液，置于冰浴中搅拌12-20 h，在0-4℃、8000-10000 rpm条件下离心超滤30-45 min，获得极化剂修饰后的丝素蛋白溶液；

11、s22：将聚乙烯亚胺溶液与pdna溶液混合均匀，涡旋60 s，在0-4℃条件下静置30-45 min，获得聚乙烯亚胺和pdna复合物；向上述获得的复合物中加入s11中获得的极化剂修饰后的丝素蛋白溶液，涡旋5-10 min，在0-4℃条件下静置30-45 min，获得层层包装形式的pdna复合基因载体。

12、在本发明的一个优选实施例中，s1和s11中所述巨噬细胞极化剂blz945的浓度为0.1-4 mg/ml，所述丝素蛋白溶液浓度为10-40 mg/ml，所述巨噬细胞极化剂blz945与丝素蛋白溶液的混合质量比为1：（10-100），所述超滤处理中超滤管的截留分子量为3000 da。

13、在本发明的一个优选实施例中，s2和s22中所述极化剂修饰后的丝素蛋白溶液浓度为1-10 mg/ml，所述聚乙烯亚胺溶液浓度为0.1-4 mg/ml，所述pdna溶液浓度为20-200 μg/ml。

14、在本发明的一个优选实施例中，s2和s22中所述复合基因载体中极化剂修饰后的丝素蛋白、聚乙烯亚胺和pdna的质量比为（10-100）：（2-20）：1。

15、本发明的目的之二在于提供上述肿瘤微环境调控复合基因载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

16、本发明的有益效果：丝素蛋白具有良好的生物相容性和生物降解性、免疫原性低，安全无毒，柞蚕丝素蛋白中富含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（rgd）三肽序列，能够特异性识别并结合肿瘤血管新生时大量表达的αvβ3和αvβ5整合素，增强基因载体与肿瘤细胞的黏附。本发明所使用的丝素蛋白包括家蚕丝素蛋白或柞蚕丝素蛋白，利用丝素蛋白中含有的天门冬氨酸和谷氨酸的羧基与巨噬细胞极化剂blz945中的羟基反应，将极化激活剂化学结合至丝素蛋白侧链；同时利用亲疏水作用、氢键等物理作用力充分负载极化剂blz945；本发明以生物相容性优异、可生物降解的丝素蛋白作为基因载体材料，不仅能保护基因不被核酸酶降解，提高转基因效率，并且载体进入肿瘤细胞中能有效释放基因，诱导肿瘤细胞凋亡。

17、本发明所使用的聚乙烯亚胺的分子量＜2500 da，利用低分子量的聚乙烯亚胺中含有大量氨基和亚氨基，导致其表面携带正电荷密度大，细胞毒性远低于高分子量的聚乙烯亚胺。同时，本发明通过将与巨噬细胞极化剂blz945反应后的丝素蛋白与低分子量的聚乙烯亚胺进行共混包装或层层包装表达肿瘤抑制基因的pdna时能够有效压缩pdna，形成尺寸更小的纳米载体，能有效稳定基因载体结构和纳米尺寸；并且易与表面携带负电荷的丝素蛋白经静电作用结合，保护pdna穿透细胞膜，提高转基因效率。

18、现有技术中，虽然也使用丝素蛋白制备载体，但其常与高锰酸钾、聚丙烯胺盐酸盐搭配制备载体；或仅通过肝素钠、聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺-穿膜肽搭配制备载体，所使用的聚乙烯亚胺分子量均较高；所使用的丝素蛋白也未经巨噬细胞极化剂blz945处理，并且与丝素蛋白相互作用的物质是不同的；现有技术中，所使用的聚乙烯亚胺的分子量较高，与本发明选用的聚乙烯亚胺标准不同，并且，包装形式与本发明所使用的共混包装或层层包装形式不同，存在实质区别。

19、本发明提供的肿瘤微环境调控复合基因载体，在酸性肿瘤微环境中，经物理解吸附和化学键断裂缓释的极化剂锚定m2巨噬细胞中过表达的csf1r，将促肿瘤m2样表型巨噬细胞极化重编程为抗肿瘤的m1样表型巨噬细胞，使其从促肿瘤表型转变为抗肿瘤表型，将肿瘤“犯罪同伙”转变为“攻击力量”；所述肿瘤微环境调控复合基因载体具有重塑免疫抑制的肿瘤微环境、调控肿瘤微环境、提高免疫抗肿瘤效应的功能。本发明所提供的肿瘤微环境调控复合基因载体能够将抗肿瘤基因转入肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡，实现双通道提高抗肿瘤治疗效果，可应用于制备抗肿瘤药物。