人源化丙型肝炎病毒（HCV）单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于免疫学和基因工程，具体涉及能够特异性识别丙型肝炎病毒（hcv）core蛋白的人源化单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、丙型肝炎病毒（hepatitis c virus，hcv），感染人体后，会引起机体的急性（短期）和慢性（长期）的病毒性肝炎，主要通过血液接触传播，此外还可以通过性接触、母婴垂直等方式传播。hcv急性感染，通常没有症状，但约70%的感染者会发展为慢性hcv感染。慢性hcv感染可能会发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等严重的肝脏疾病。目前，暂时没有针对hcv的疫苗，但可以使用抗病毒药物治疗hcv感染，因此，hcv 感染的及时检测、诊断与治疗，是减少 hcv 血液传播、防治丙肝的关键。

2、hcv为单股正链 rna病毒，基因组大小约为9500~10000bp ，包含一个大的编码开放阅读框架，编码了约3000个氨基酸的多聚蛋白前体。该蛋白前体在细胞和病毒自身编码的蛋白酶作用下，形成成熟的结构蛋白和非结构蛋白，即核心蛋白（core）和包膜糖蛋白（e1、e2）等结构蛋白，p7、ns2蛋白酶、ns3-4a复合物、ns4b、ns5a和ns5b等非结构蛋白。目前，国内外临床上最常用的hcv感染特异性诊断方法是抗hcv和hcv rna检测。抗hcv检测因其成本低、操作简单，更适合大规模筛查试验；hcv rna检测则对hcv的确诊和指导hcv抗病毒治疗具有重要意义。

3、抗hcv检测，是采用基因工程技术，表达hcv基因中部分结构蛋白、非结构蛋白作为包被抗原，来建立的检测方法。目前，已经研制出四代抗-hcv检测试剂。第一代抗hcv检测，使用ns4区编码的重组抗原c100-3；第二代，使用了core区的c22-3重组抗原，ns3区的c33c重组抗原和ns4区的c100-3；第三代，增加了ns5区的重组抗原，并重新配置core区和ns3区的重组抗原，提高了试剂灵敏度；第四代，加入了生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem，bas），进一步提高了试剂的灵敏度。

4、抗hcv检测技术的发展和大规模应用，对hcv流行病学调查、献血员筛查、高危人群监测和临床hcv患者的诊断都有着重要的意义，更是为hcv感染的早发现、早治疗，提供了坚实可靠的依据，因此，为了监测和评价各实验室抗hcv检测的水平、质量，室内质控品和室间质评样品得到大规模的应用。而现有的抗hcv室内质控品、室间质评样品，多为临床强阳性血清/血浆样品制备而来，涉及生物安全和伦理问题，难以获取。此外，样品成分复杂，原料批间差异难以控制，导致质控产品的批间质量差异较大。

技术实现思路

1、针对抗hcv质控产品的原料来源问题，本发明的目的在于提供能特异性识别hcvcore蛋白的人源化抗hcv单克隆抗体及其作为抗hcv室内质控品的应用。

2、本发明提供的人源化抗hcv单克隆抗体其特征在于：所述抗体能够特异性识别hcvcore蛋白，包括轻链和重链，其重链可变区氨基酸序列见seq id no.1，其轻链可变区氨基酸序列见seq id no.2。

3、进一步的，本发明还提供了针对人源化抗hcv单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

4、（1）选取hcv core蛋白，分别免疫balb/c小鼠，得到经过免疫处理的小鼠；

5、（2）基于步骤（1）所述免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，并通过有限稀释法和elisa法筛选高效价的特异性单抗；

6、（3）将步骤（2）中所述单抗进行杂交瘤细胞可变区基因测序，得到基因序列，并将该基因序列与人igg1基因架构结合，构建真核表达质粒；

7、（4）将步骤（3）中所述真核表达质粒转染cho-s细胞，构建稳转细胞株，并使用该稳转细胞株表达、制备人源化单克隆抗体。

8、进一步的，本发明提供一种抗hcv室内质控品，采用人源化抗hcv单克隆抗体为原料，制备成均匀性好、稳定性好、互通性好的室内质控品，实现了所述人源化单克隆抗体的初步应用。

9、进一步的，本发明提供的抗hcv室内质控品，包含人源化抗hcv单克隆抗体、人血清基质、氯化钠、蛋白保护剂、防腐剂等组分。所述人源化抗hcv单克隆抗体为特异性识别hcvcore蛋白的人源化单克隆抗体，所述防腐剂为proclin300和proclin950种的一种或两种。

10、进一步的，本发明提供一种抗hcv室内质控品的制备方法，包括以下步骤：

11、（1）将人血清基质放入（2~8）℃环境中，至完全溶解。再经过60℃处理60分钟，除菌过滤后，得到经处理的人血清基质。

12、（2）在搅拌的情况下，依次往步骤（1）经过处理的人血清基质中加入人源化抗hcv单克隆抗体、氯化钠、蛋白保护剂和防腐剂，再使用经过处理的人血清基质定容至目标配制体积，充分混合均匀，得到抗hcv室内质控品半成品。

13、（3）使用elisa试剂盒，测定步骤（2）中的抗hcv室内质控品半成品，判断质控品浓度是否符合质检标准。符合标准的，即为合格的抗hcv室内质控品半成品。

14、（4）步骤（3）中，合格的抗hcv室内质控品半成品，根据需求的装量进行分装，贴标签，得到成品的抗hcv室内质控品。质控品在-20℃条件下保存。

15、相对于现有的技术，本发明的有益效果如下：

16、1、本发明提供了特异性识别hcv core蛋白的人源化抗hcv单克隆抗体，并公开了所述人源化抗hcv单克隆抗体的氨基酸序列。本发明提供的人源化抗hcv单克隆抗体，特异性识别的hcv结构蛋白，均为抗hcv检测试剂盒常用的包被和/或标记原料，且经过人源化改造，还能特异性结合抗人igg抗体，兼容多种夹心法、间接法等方法学原理的商业化抗hcv免疫检测试剂盒。此外，人源化抗hcv单克隆抗体便于放大生产、批间差异小、成本低廉，将其作为抗hcv室内质控品、室间质评样品的材料，具有广大的应用前景。

17、2、本发明提供的抗hcv室内质控品，采用了人源化抗hcv单克隆抗体，可兼容多种夹心法、间接法等方法学原理的商业化抗hcv免疫检测试剂盒，是真正的第三方质控品。此外，抗hcv室内质控品使用人血清基质作为质控基质，与临床样本的基质相近，大大提高了室内质控品的互通性，更能满足各实验室对监测和评价抗hcv试验质量的要求。

技术特征：

1.一种人源化抗hcv单克隆抗体，其特征在于：所述抗体能够特异性识别hcv core蛋白，包括轻链和重链，其重链可变区氨基酸序列见seq id no.1，其轻链可变区氨基酸序列见seq id no.2。

2.权利要求1所述的人源化抗hcv单克隆抗体，其特征在于，其制备方法，包括以下步骤：

3.一种抗hcv室内质控品，其特征在于：含有权利要求1所述的人源化抗hcv单克隆抗体、人血清基质、氯化钠、蛋白保护剂、防腐剂。

4.权利要求3所述的抗hcv室内质控品，其特征在于：按浓度计，人源化抗hcv单克隆抗体含量为1.0-200 ng/ml；按重量百分比计，氯化钠含量为0.5-1.2%，蛋白保护剂含量为0.1%-5%，防腐剂含量为0.02%-0.3%；按体积算，人血清基质定容至目标配制体积。

5.权利要求3或4所述的抗hcv室内质控品，其特征在于，所述防腐剂为proclin300和proclin950。

6.权利要求3或4所述的抗hcv室内质控品，其特征在于，所述质控品为液体。

7.权利要求3或4所述的抗hcv室内质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.权利要求3或4所述的抗hcv室内质控品，其特征在于，在-20℃条件下能稳定保存不低于2年；在（2~8）℃条件下能稳定保存不低于1年。

技术总结本发明公开了一种人源化抗丙型肝炎病毒（HCV）单克隆抗体，其中所述抗体命名为C00012，为特异性结合HCV Core蛋白，所述抗体的重链可变区氨基酸序列依次见SEQ ID NO.1，所述抗体的轻链可变区氨基酸序列依次见SEQ ID NO.2。本发明还公开了所述人源化抗HCV单克隆抗体在制备抗HCV室内质控品中的应用。实验证实本发明的人源化抗HCV单克隆抗体，能特异识别HCV的Core蛋白，且能被抗人IgG抗体结合，兼容夹心法、间接法等方法学原理的抗HCV免疫检测试剂盒。由其制备的抗HCV室内质控品，均有均匀性好、稳定性好、互通性好等优点，对抗HCV的试验质量控制，具有重要的应用价值。技术研发人员：高旭年,华文浩,李尔华,林健聪,吴淑贤,孙洁华受保护的技术使用者：广州邦德盛生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2025/1/6