工程化的ADAR募集RNA及其使用方法

本技术涉及使用能够募集使靶rna中的一个或多个腺苷脱氨基的腺苷脱氨基酶的工程化线性或环状rna来编辑rna的方法和组合物。

背景技术：

1、基因组编辑是用于生物医学研究和疾病治疗开发的强大工具。使用工程化核酸酶，如锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)和crispr系统的cas蛋白的编辑技术已被应用于操纵无数生物体的基因组。最近，利用脱氨基酶蛋白质，如作用于rna的腺苷脱氨基酶(adar)，开发了用于rna编辑的新工具。在哺乳动物细胞中，存在三种类型的adar蛋白，adar1(两种同种型，p110和p150)、adar2和adar3(催化失活)。adar蛋白的催化底物是双链rna，adar可以去除腺苷(a)核碱基上的-nh2基团，将a变为肌苷(i)。(i)在随后的细胞转录和翻译过程中被识别为鸟苷(g)并与胞苷(c)配对。为了实现靶向rna编辑，adar蛋白或其催化结构域与λn肽、snap标签或cas蛋白(dcas13b)融合，并设计了一种引导rna，以将嵌合adar蛋白募集到靶位点。或者，据报道过表达adar1或adar2蛋白以及带有r/g基序的引导rna可以实现靶向rna编辑。

2、然而，目前可用的adar介导的rna编辑技术具有某些局限性。例如，基因治疗最有效的体内递送是通过病毒载体，但非常理想的腺相关病毒(aav)载体受到货物大小(～4.5kb)的限制，这使得同时容纳蛋白质和引导rna具有挑战性。此外，最近据报道，由于对rna的异常超编辑，adar1的过表达在多发性骨髓瘤中赋予致癌性，并产生大量的全局脱靶编辑。此外，非人类来源的蛋白质或其结构域的异位表达具有引发免疫原性的潜在风险。此外，预先存在的适应性免疫和p53介导的dna损伤响应可能会抵消治疗性蛋白(诸如cas9)的功效。

技术实现思路

1、本技术提供了使用adar募集rna(“drna”或“arrna”)进行rna编辑的方法，所述adar募集rna包括环状adar募集rna(“circ-drna”或“环状-arrna”)，其能够利用作用于rna蛋白的内源性腺苷脱氨基酶(“adar”)进行rna编辑。本文还提供了工程化drna或包含编码用于这些方法中的工程化drna的核酸序列的构建体，以及包含它们的组合物和试剂盒。本文进一步提供了用于治疗或预防个体的疾病或病况的方法，其包括编辑与个体细胞的疾病或病况相关的靶rna。

2、在一个方面，本文提供了一种在宿主细胞中编辑靶rna中的靶腺苷的方法，其包括将脱氨基酶募集rna(drna)或包含编码drna的核酸序列的构建体引入所述宿主中细胞，其中：(1)所述drna包含能够与靶rna杂交形成双链rna的靶向rna序列，其中所述双链rna包含含有所述靶rna中的非靶腺苷的凸起；并且(2)所述drna能够募集作用于rna的腺苷脱氨基酶(adar)。在一些实施方案中，双链rna在靶rna中的每个非靶腺苷处包含凸起。在一些实施方案中，靶向rna序列与靶rna互补，除了与靶rna中的非靶腺苷相对的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，靶向rna序列与靶rna互补，除了缺少与靶rna中的非靶腺苷相对的两个或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述方法包括降低靶rna中非靶腺苷的编辑水平。

3、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，drna是线性rna。在一些实施方案中，drna是能够形成环状rna的线性rna。在一些实施方案中，drna是环状rna。

4、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，drna包含侧接靶向rna序列的末端的接头核酸序列，其中接头核酸序列基本上不与drna的任何部分形成任何二级结构。

5、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，drna包含取代靶向rna序列的末端的接头核酸序列，其中接头核酸序列基本上不与drna的任何部分形成任何二级结构。

6、在另一方面，本文提供了一种在宿主细胞中编辑靶rna中的靶腺苷的方法，其包括将drna或包含编码drna的核酸序列的构建体引入所述宿主细胞，其中(1)drna包含能够与靶rna杂交的靶向rna序列，其中drna包含侧接靶向rna序列的末端的接头核酸序列，其中接头核酸序列基本上不与drna的任何部分形成任何二级结构；(2)drna能够募集adar；并且(3)drna为环状rna或能够形成环状rna的线性rna。在一些实施方案中，drna是环状rna。在一些实施方案中，drna是能够形成环状rna的线性rna。

7、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，其中drna包含接头核酸序列，接头核酸序列的长度为约5个核苷酸(nt)至约500nt。在一些实施方案中，接头核酸序列的长度为约50nt至约500nt。在一些实施方案中，接头核酸序列的长度为约5个核苷酸(nt)至约500nt。在一些实施方案中，接头核酸序列的长度小于或等于70nt，任选地，其中接头核酸序列的长度是10nt-50nt、10nt-40nt、10nt-30nt、10nt-20nt、20nt-50nt、20nt-40nt、20nt-30nt、30nt-50nt、30nt-40nt或40nt-50nt之间的任何整数。在一些实施方案中，接头核酸序列的长度为约20nt至约60nt；任选地，其中接头核酸序列的长度为约30nt，或约50nt。在一些实施方案中，至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％中的任一项的接头核酸序列包含腺苷或胞苷；任选地，其中100％的接头核酸序列包含腺苷或胞苷。在一些实施方案中，接头核酸序列包含聚腺苷(polya)、聚鸟苷(polyg)或聚胞嘧啶(polyc)序列。在一些实施方案中，至少50％的接头核酸序列包含腺苷。在一些实施方案中，接头核酸序列包含二核苷酸重复序列。在一些实施方案中，接头核酸序列包含(at)n，其中n是大于或等于3的整数。在一些实施方案中，接头核酸序列包含seq id no:22。

8、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，其中drna包含接头核酸序列，drna包含侧接靶向rna序列的5’端的第一接头核酸序列和侧接靶向rna序列的3’端的第二接头核酸序列。在一些实施方案中，drna包含侧接靶向rna序列的5’端的第一接头核酸序列和取代靶向rna序列的3’端的第二接头核酸序列。在一些实施方案中，drna包含取代靶向rna序列的5’端的第一接头核酸序列和侧接靶向rna序列的3’端的第二接头核酸序列。在一些实施方案中，drna包含取代靶向rna序列的5’端的第一接头核酸序列和取代靶向rna序列的3’端的第二接头核酸序列。在一些实施方案中，第一接头核酸序列与第二接头核酸序列相同。在一些实施方案中，第一接头核酸序列不同于第二接头核酸序列。在一些实施方案中，drna是环状rna，并且接头核酸序列连接靶向rna序列的5’端和靶向rna序列的3’端。

9、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，其中drna是环状rna，drna进一步包含3’外显子序列和5’外显子序列，所述3’外显子序列可被侧接靶向rna序列的5’端的3’催化性i组内含子片段识别，所述5’外显子序列可被侧接靶向rna序列的3’端的5’催化性i组内含子片段识别。

10、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，drna进一步包含3’连接序列和5’连接序列。在一些实施方案中，3’连接序列和5’连接序列彼此至少部分互补。在一些实施方案中，3’连接序列和5’连接序列的长度为约20至约75个核苷酸。在一些实施方案中，连接序列的长度为约5个核苷酸(nt)至约500nt。在一些实施方案中，连接序列的长度小于或等于70nt，任选地，其中连接序列的长度是10nt-50nt、10nt-40nt、10nt-30nt、10nt-20nt、20nt-50nt、20nt-40nt、20nt-30nt、30nt-50nt、30nt-40nt或40nt-50nt之间的任何整数。在一些实施方案中，连接序列的长度为约20nt至约60nt；任选地，其中连接序列的长度为约30nt，或约50nt。在一些实施方案中，至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的任一项的连接序列包含腺苷或胞苷；任选地，其中100％的连接序列包含腺苷或胞苷。在一些实施方案中，drna被rna连接酶rtcb环化。在一些实施方案中，rna连接酶rtcb在宿主细胞中内源性表达。在一些实施方案中，drna被t4 rna连接酶1(rnl1)或rna连接酶2(rnl2)环化。

11、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，drna或包含编码drna的核酸序列的构建体以剂量依赖性方式编辑靶rna中的靶腺苷。

12、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，所述方法包括将包含编码drna的核酸序列的构建体引入所述宿主细胞。在一些实施方案中，构建体进一步包含与编码drna的核酸序列可操作连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是聚合酶ii启动子(“pol ii启动子”)。在一些实施方案中，启动子是聚合酶iii启动子(“pol iii启动子”)。在一些实施方案中，所述构建体是病毒载体或质粒。在一些实施方案中，所述构建体是腺相关病毒(aav)载体。在一些实施方案中，所述构建体是自互补aav(scaav)。

13、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，adar由宿主细胞内源性表达。在一些实施方案中，宿主细胞是t细胞。

14、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，靶向rna序列的长度为约100至约200nt(例如，约150nt或约170nt)。在一些实施方案中，靶向rna序列包含与靶rna中的靶腺苷直接相对的胞苷、腺苷或尿苷。在一些实施方案中，靶向rna序列包含与靶rna中的靶腺苷直接相对的胞苷错配。在一些实施方案中，胞苷错配位于距靶向rna序列的3’端至少20个核苷酸，并且距靶向rna序列的5’端至少5个核苷酸处。在一些实施方案中，靶rna中靶腺苷的5’最近邻是选自u、c、a和g的核苷酸，优先度为u＞c≈a＞g，并且靶腺苷的3’最近邻是靶rna是选自g、c、a和u的核苷酸，优先度为g＞c＞a≈u。在一些实施方案中，靶腺苷在uag的三碱基基序中，并且其中靶向rna包含与三碱基基序中的尿苷直接相对的a、与靶腺苷直接相对的胞苷，以及与三碱基基序中的鸟苷直接相对的胞苷、鸟苷或尿苷。

15、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，靶rna是选自下组的rna：前信使rna、信使rna、核糖体rna、转移rna、长链非编码rna和小rna。编码rna和小rna。在一些实施方案中，靶rna是前信使rna。

16、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，所述方法还包括将adar3抑制剂和/或干扰素刺激剂引入所述宿主细胞。

17、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，所述方法包括将各自靶向不同靶rna的多个drna或构建体引入所述宿主细胞。

18、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，编辑靶rna的效率为至少40％。

19、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括将adar引入所述宿主细胞。

20、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，靶rna中的靶腺苷脱氨基导致靶rna中的错义突变、早期终止密码子、异常剪接或选择性剪接，或靶rna中的错义突变、早期终止密码子、异常剪接或选择性剪接的逆转。在一些实施方案中，靶rna中的靶腺苷脱氨基导致由靶rna编码的蛋白质的点突变、截短、延长和/或错误折叠，或通过逆转靶rna中的错义突变、早期终止密码子、异常剪接或选择性剪接的功能性、全长、正确折叠和/或野生型蛋白质。

21、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人或小鼠细胞。

22、在另一个方面，本文提供了通过上述任一项方法产生的编辑的rna或具有编辑的rna的宿主细胞。

23、在另一个方面，本文提供了一种用于治疗或预防个体的疾病或病况的方法，其包括根据上述任一项方法在个体的细胞中编辑与疾病或病况相关的靶rna。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性基因疾病或与一种或多种获得性基因突变相关的疾病或病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况是单基因或多基因疾病或病况。在一些实施方案中，靶rna具有g到a的突变。

24、在根据上述任一项方法的一些实施方案中，靶rna是tp53，而所述疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，靶rna是idua，而所述疾病或病况是i型粘多糖贮积症(mps i)。在一些实施方案中，靶rna是col3a1，而所述疾病或病况是埃勒斯-当洛(ehlers-danlos)综合征。在一些实施方案中，靶rna是bmpr2，而所述疾病或病况是朱伯特(joubert)综合征。在一些实施方案中，靶rna是fancc，而所述疾病或病况是范可尼贫血。在一些实施方案中，靶rna是mybpc3，而所述疾病或病况是原发性家族性肥厚型心肌病。在一些实施方案中，靶rna是il2rg，而所述疾病或病况是x连锁严重联合免疫缺陷。在一些实施方案中，靶rna是malat1，而所述疾病或病况是高血糖症。在一些实施方案中，靶rna是rab7a，而所述疾病或病况是2b型夏马图(charcot-marie-tooth)症(cmt2b)。

25、还提供了用于上述任一项方法的组合物、试剂盒和制品。

26、在另一个方面，本文提供了用于编辑靶rna的drna，其包含能够与靶rna杂交以形成双链rna的靶向rna序列，其中双链rna包含含有靶rna中的非靶腺苷的凸起。在一些实施方案中，双链rna在靶rna中的每个非靶腺苷处包含凸起。在一些实施方案中，靶向rna序列与靶rna互补，除了与靶rna中的非靶腺苷相对的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，靶向rna序列与靶rna互补，除了与靶rna中的非靶腺苷相对的两个或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述方法包括降低靶rna中非靶腺苷的编辑水平。

27、在根据上述任一项drna的一些实施方案中，drna是线性rna。在一些实施方案中，drna是能够形成环状rna的线性rna。在一些实施方案中，drna是环状rna。

28、在根据上述任一项drna的一些实施方案中，drna包含侧接靶向rna序列的末端的接头核酸序列，其中接头核酸序列基本上不与drna的任何部分形成任何二级结构。在一些实施方案中，drna包含取代靶向rna序列的末端的接头核酸序列，其中接头核酸序列基本上不与drna的任何部分形成任何二级结构。

29、在本文中呈现的另一个方面是用于编辑靶rna的drna，其包含能够与靶rna杂交的靶向rna序列，其中drna包含侧接靶向rna序列的末端的接头核酸序列，其中接头核酸序列基本上不与drna的任何部分形成任何二级结构，并且其中drna是环状rna或能够形成环状rna的线性rna。在一些实施方案中，drna是环状rna。在一些实施方案中，drna是能够形成环状rna的线性rna。

30、在本文中呈现的另一个方面是用于编辑靶rna的drna，其包含能够与靶rna杂交的靶向rna序列，其中所述drna包含取代靶向rna序列的末端的接头核酸序列，其中接头核酸序列基本上不与drna的任何部分形成任何二级结构，并且其中drna是环状rna或能够形成环状rna的线性rna。在一些实施方案中，drna是环状rna。在一些实施方案中，drna是能够形成环状rna的线性rna。

31、在根据上述任一项drna的一些实施方案中，其中drna包含接头核酸序列，接头核酸序列的长度为约5个核苷酸(nt)至约500nt。在一些实施方案中，接头核酸序列的长度为约50nt至约500nt。在一些实施方案中，接头核酸序列的长度为约5个核苷酸(nt)至约500nt。在一些实施方案中，接头核酸序列的长度小于或等于70nt，任选地，其中接头核酸序列的长度是10nt-50nt、10nt-40nt、10nt-30nt、10nt-20nt、20nt-50nt、20nt-40nt、20nt-30nt、30nt-50nt、30nt-40nt或40nt-50nt之间的任何整数。在一些实施方案中，接头核酸序列的长度为约20nt至约60nt；任选地，其中接头核酸序列的长度为约30nt，或约50nt。在一些实施方案中，至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％中的任一项的接头核酸序列包含腺苷或胞苷；任选地，其中100％的接头核酸序列包含腺苷或胞苷。在一些实施方案中，接头核酸序列包含聚腺苷(polya)、聚鸟苷(polyg)或聚胞嘧啶(polyc)序列。在一些实施方案中，至少50％的接头核酸序列包含腺苷。在一些实施方案中，接头核酸序列包含二核苷酸重复序列。在一些实施方案中，接头核酸序列包含(at)n，其中n是大于或等于3的整数。

32、在根据上述任一项drna的一些实施方案中，其中drna包含接头核酸序列，drna包含侧接靶向rna序列的5’端的第一接头核酸序列和侧接靶向rna序列的3’端的第二接头核酸序列。在一些实施方案中，drna包含侧接靶向rna序列的5’端的第一接头核酸序列和取代靶向rna序列的3’端的第二接头核酸序列。在一些实施方案中，drna包含取代靶向rna序列的5’端的第一接头核酸序列和侧接靶向rna序列的3’端的第二接头核酸序列。在一些实施方案中，drna包含取代靶向rna序列的5’端的第一接头核酸序列和取代靶向rna序列的3’端的第二接头核酸序列。在一些实施方案中，第一接头核酸序列与第二接头核酸序列相同。在一些实施方案中，第一接头核酸序列不同于第二接头核酸序列。在一些实施方案中，drna是环状rna，并且接头核酸序列连接靶向rna序列的5’端和靶向rna序列的3’端。

33、在根据上述任一项drna的一些实施方案中，其中drna是环状rna，drna进一步包含3’外显子序列和5’外显子序列，所述3’外显子序列可被侧接靶向rna序列的5’端的3’催化性i组内含子片段识别，所述5’外显子序列可被侧接靶向rna序列的3’端的5’催化性i组内含子片段识别。

34、在根据上述任一项drna的一些实施方案中，drna进一步包含3’连接序列和5’连接序列。在一些实施方案中，3’连接序列和5’连接序列彼此至少部分互补。在一些实施方案中，3’连接序列和5’连接序列的长度为约20至约75个核苷酸。在一些实施方案中，drna被rna连接酶rtcb环化。在一些实施方案中，rna连接酶rtcb在宿主细胞中内源性表达。在一些实施方案中，drna被t4 rna连接酶1(rnl1)或rna连接酶2(rnl2)环化。

35、在根据上述任一项drna的一些实施方案中，靶向rna序列的长度为约100至约200nt(例如，约150nt或约170nt)。在一些实施方案中，靶向rna序列包含与靶rna中的靶腺苷直接相对的胞苷、腺苷或尿苷。在一些实施方案中，靶向rna序列包含与靶rna中的靶腺苷直接相对的胞苷错配。在一些实施方案中，胞苷错配位于距靶向rna序列的3’端至少20个核苷酸，并且距靶向rna序列的5’端至少5个核苷酸处。在一些实施方案中，靶rna中靶腺苷的5’最近邻是选自u、c、a和g的核苷酸，优先度为u＞c≈a＞g，并且靶rna中靶腺苷的3’最近邻是选自g、c、a和u的核苷酸，优先度为g＞c＞a≈u。在一些实施方案中，靶腺苷在uag的三碱基基序中，并且其中靶向rna包含与三碱基基序中的尿苷直接相对的a、与靶腺苷直接相对的胞苷，以及与三碱基基序中的鸟苷直接相对的胞苷、鸟苷或尿苷。

36、在根据上述任一项drna的一些实施方案中，靶rna是选自下组的rna：前信使rna、信使rna、核糖体rna、转移rna、长链非编码rna和小rna。在一些实施方案中，靶rna是前信使rna。

37、在一些实施方案中，提供了一种构建体，其包含编码上述任一项drna的核酸序列。在一些实施方案中，构建体进一步包含与编码drna的核酸序列可操作连接的启动子，其中该启动子是pol iii启动子。在一些实施方案中，所述构建体是病毒载体或质粒。在一些实施方案中，所述构建体是腺相关病毒(aav)载体。在一些实施方案中，所述构建体是自互补aav(scaav)。

38、在一些实施方案中，提供了包含上述任一项构建体或drna的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含上述任一项构建体或drna的试剂盒，其中试剂盒进一步包含用于在宿主细胞中编辑靶rna的说明书。

39、应当理解，本文描述的各种实施例的一个、一些或所有特性可以组合以形成本技术的其他实施例。本技术的这些和其他实施例通过下面的具体实施方式进一步描述。