一种基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法及其鉴定用引物和应用与流程

本发明属于微卫星标记，具体涉及一种基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法及其鉴定用引物和应用。

背景技术：

1、鱼类的准确鉴定对于生态学研究、水产养殖和保护生物多样性至关重要。鱼类作为最原始的脊椎动物，是生物进化史中存在杂交的一大类群，表现出原始性、复杂性及多样性。线粒体引物在杂交物种鉴定上存在局限性，开发特异分子标记是目前鉴定鱼类物种及保护开发的重要方法。

2、苏氏圆腹（鱼芒）（ pangasius sutchi或 pangasianodonhypophthalmus）隶属于鲇形目，巨鲇科，无齿（鱼芒）属，又称淡水鲨鱼。该鱼为热带杂食性鱼类，具有生长速度快、抗病力强、耐低氧、出肉率高、肉质鲜嫩无肌间刺等优点，同时鱼皮可用于制作明胶，鱼骨可用于提取药用成分硫酸软骨素，是优良的淡水养殖品种。长丝（鱼芒）（ pangasius  sanitwongsei smith，1931）隶属于鲇形目，巨鲇科，（鱼芒）属，原产于湄南河与湄公河流域，喜栖息于深水区，在自然生活环境下为肉食性鱼类，以摄食鱼、虾、蟹等水生动物为主，产卵集中在4～5月，长丝肉质嫩滑，味道鲜美，生长速度快，是经济价值较高的水产品种。此外，长丝（鱼芒）还具有较高的观常价值，其宽阔的头部、矫健的游姿及胸鳍、腹鳍和背鳍上特有的飘鳍等，深受观常鱼类养殖者喜爱。

3、鱼类是现存数量和种类最多的脊椎动物，目前认为其起源过程中曾经历多次基因组多倍化及复杂的杂交事件，导致不同基因组间的融合、染色体组的加倍，具有丰富的遗传多样性。鱼类的远缘杂交可以促进多倍化的发生，而杂交和多倍化对于鱼类的遗传育种、进化研究具有重要的意义。鱼类杂交获得的后代—杂交鱼有时能继承双亲的一些遗传特征甚至不利的性状，有时能获得亲本某方一些经选择的或有利的性状，还可能具有超越亲本双方的一些优良性状，如生长速度快、肉质好、抗病能力强、环境耐性高等，即杂交优势。人们为了改善苏氏圆腹（鱼芒）和长丝（鱼芒）的种质资源优势，开展了二者的杂交育种，杂交子一代获得杂种优势的同时，在形态上与双亲具有高度的相似性，使得形态学鉴定存在不准确性的风险，常用的线粒体标记进行物种鉴定存在无法区分母源物种的局限性。

4、使用传统的分类工具在港口检查期间识别具有重要生物经济意义的鲨鱼非常困难（甚至不可能），因为在海上进行加工时，头部和鳍被移除。在加工过程中，对准确识别标本至关重要的形态学和分生标准丢失了。目前已经开发了几种不同的遗传鉴定方法来解决错误鉴定问题或揭示捕获的濒危鲨鱼物种。这些包括基于凝胶的鉴定方法，dna条形码，基于测序的鉴定方法（使用细胞色素b的序列和高分辨率熔解分析）。此外，最近一些研究证明了跨物种微卫星在基于物种特异性等位基因大小和多个位点的独特等位基因频率方面发挥重要作用。因此，为了能更好的鉴别出苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种，利用微卫星标记稳定性、重复性高、操作简便等特点，急需开发适用于鉴别杂交种与亲本的分子标记。

5、三代测序平台pacbio sequelⅱ应用smrt 测序技术实现单分子实时测序。smrt测序原理是以smrt cell为载体，每个smrt cell上布满了数百万个零模波导孔（zmw），测序时dna聚合酶和一条模板分子被瞄定在zmw孔底部进行反应，位于小孔底部的激发光能够激发核苷酸底物上的荧光标记，进而通过监测系统将荧光信号记录下来，从而获得碱基信息。整个测序过程 dna 分子不需要经过pcr扩增，实现了对每一条dna分子的单独测序。它的优点如下：a.长读长、高产出；b.高一致性准确度；c.均匀的覆盖度；d.高精准度的长读长hifireads；e.可进行单倍体组装。三代测序在物种基因组分析和组装中起着重要的作用，其高分辨率大大提高了物种基因组组装的完整性。利用基因组单倍型组装获得了杂交种双亲的单倍型，基于单倍型分析查找三者之间的核基因组的特异性序列，开发适用于区分杂交鱼与亲本的分子标记，有助于增殖放流、港口、海关等进行高效、准确的物种鉴定。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法及其鉴定用引物和应用。采用该方法和引物可准确鉴定区分苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种，为批量高效鉴定苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种物种奠定技术基础。

2、为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

3、基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的鉴定用引物，所述引物包括ps-chr-4-1 和 py-chr-4-2两对引物，引物的序列如下表1所示：

4、

5、进一步的，所述的ps-chr-4-1和py-chr-4-2两对引物的序列依序分别如seq idno：1～4所示。

6、所述的鉴定用引物在鉴定区分苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种中的应用。

7、另一方面，本发明还提供了一种基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法，采用该方法进行鉴定区分苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种，具体包括以下步骤：

8、（1）苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）、杂交种基因组dna提取：采集苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种的尾鳍组织样品，分别提取基因组dna；

9、（2）合成上述的两对微卫星标记引物：ps-chr-4-1 和 py-chr-4-2；

10、（3）pcr反应扩增：分别取所述步骤（1）获取的苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）、杂交种基因组dna和步骤（2）合成的所述两对微卫星标记引物进行pcr反应；

11、（4）基因分型：将pcr产物在1.5 % 琼脂糖凝胶上电泳，以dl2000 maker为dna分子量标准参考，通过凝胶成像系统显影检测pcr产物条带；

12、（5）（鱼芒）鱼物种判定：ps-chr-4-1、py-chr-4-2的pcr产物片段大小分别为204bp、229bp；供试品凝胶电泳图中，若ps-chr-4-1、py-chr-4-2的pcr产物均检测到有条带为杂交个体；若ps-chr-4-1的pcr产物有条带，py-chr-4-2的无条带，为长丝（鱼芒）；若ps-chr-4-1的pcr产物无条带，py-chr-4-2的有条带，为苏氏圆腹（鱼芒）。

13、进一步的，上述的基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法，步骤（1）中：采集苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种的尾鳍组织样品，采用高盐法、酚/氯仿提取法、商业化dna提取试剂盒或磁珠法等提取法获得每个个体的基因组dna，保存备用。

14、进一步的，上述的基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法，步骤（3）中，pcr反应体系为：6.25 μl taq酶pcr预先混合液，1.0 μl模板基因组dna，上下游扩增引物各0.5 μl（浓度10μm），加4.25 μl ddh2o至总体积12.5μl；所述taq酶pcr预先混合液中的主要成分为0.1u/μl taq dna聚合酶、2x pcr反应缓冲液、3 mm mgcl2，以及0.4 mm dntps。pcr反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性40s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，72℃终延伸5min，4℃保存。

15、进一步的，上述的基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法，步骤（3）中，苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）、杂交种基因组dna的浓度为50±20 ng/μl，上下游扩增引物浓度10 um。

16、所述的基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法在鉴定区分苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种中的应用。

17、注：本文中所述的（鱼芒）为一个字，由于该字是生僻字未能显示出来，因此用鱼芒两个字来拼，并括号起来进行表示。

18、本发明的有益效果为：

19、1、本发明公开了一种基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的鉴定用引物（ps-chr-4-1和 py-chr-4-2），本发明基于杂交种中双亲基因组单倍型作为基础，进行基因组单倍型比较分析，查找双亲可遗传的特异性微卫星标记，基于该序列片段分别进行引物设计并验证，经群体验证之后，发现该引物可以准确鉴定苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种，准确率为100%。

20、2、本发明利用三代测序与二代测序相结合，组装出高质量的亲本单倍型，通过亲本单倍型比较获得亲本特异性微卫星标记，依据琼脂糖凝胶电泳进行微卫星分型，对苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）、杂交种进行了高效准确的物种鉴定。本发明为（鱼芒）鱼的鉴定提供了新的方法，为批量鉴定苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种物种奠定了技术基础。

21、3、本发明筛选的2个特异性微卫星标记，主要为亲本特有且具有遗传性，其扩增效果稳定、清晰、特异性强，为后期数据规整提供了较客观的依据，仅使用两对引物即可完成（鱼芒）鱼的鉴定，大大降低了成本和工作量。

22、4、本发明公开的一种基于微卫星标记鉴定（鱼芒）鱼的方法，该方法通过提取苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）、杂交种个体样本的基因组dna，利用所限定的鉴定用引物对获得的dna基因组进行pcr扩增，使用1.5%琼脂糖凝胶对pcr扩增产物进行电泳、显影；根据特异性片段的有无区分苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）、杂交种。本发明方法简单、高效、快捷、准确，采用该方法可准确鉴定区分苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）及其杂交种，可在苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）、杂交种的种质鉴定、家系遗传管理方面推广应用。

23、5、本发明主要利用稳定表达的物种特异性核基因微卫星标记作为物种鉴定方法，可鉴别出苏氏圆腹（鱼芒）、长丝（鱼芒）和杂交种，克服了线粒体基因鉴定的短板，仅使用两对引物完成鉴定，提高了微卫星标记的工作效率。