一种调节补体C5表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种调节补体c5表达的sirna、其缀合物和药物组合物及用途。

背景技术：

1、补体系统是一种古老的宿主防御系统，其生物起源可以追溯至十多亿年前，因其在杀菌和吞噬过程中的辅助作用被命名为补体(complement)。固有免疫和适应性免疫都包含补体系统，它通过调理和裂解作用来保卫宿主的血管内环境。通常，补体系统始于三种激活途径，分别是经典途径、凝集素途径和旁路途径。经典途径始于补体因子c1的c1q片段与抗原-抗体复合物的结合。凝集素是碳水化合物结合蛋白，凝集素途径始于甘露糖结合凝集素与外源细胞或损伤宿主细胞表面的多糖或糖蛋白基序结合。旁路激活途径与经典激活途径不同之处在于激活是越过了c1、c4、c2三种成分，直接激活c3，在b因子、d因子和备解素(p)参与下，形成c3转化酶和c5转化酶，启动级联酶促反应。补体存在于激活和调节之间的微妙平衡中。当这种平衡被破坏时，组织就会受损，疾病也会随之而来。补体与许多不同的疾病有关，在某些情况下，驱动病理，而在其他情况下，放大或加剧非补体疾病触发器的炎症和破坏性影响，抗补体治疗被认为在这些疾病的治疗中起着关键作用。

2、在许多补体成分中，c5在补体级联反应中具有重要作用，并已成为包括阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、溶血性尿毒症综合征(ahus)、重症肌无力(mg)、iga肾炎等在内的许多疾病的主要治疗靶点。c5抑制能有效地靶向末端补体通路，阻断c5a的释放和膜攻击复合物(mac)组装。目前，针对治疗补体相关的疾病的药物主要为多肽和单克隆抗体，以c5为靶点的药物研发类型主要是抗体类药物(参见，参考文献1-11)；在研适应症以pnh、hus、mg为主；有多个项目处于后期开发阶段，目前有两款药物已批准上市：eculizumab(商品名soliris)和ravulizumab(商品名ultomiris)。虽然这两个药物可以较好地控制溶血、减少炎症反应，但eculizumab/ravulizumab对部分有snp突变的pnh患者没有效果。此外抗体类药物半衰期短，持续有效时间短，用药费用昂贵。显然这些药物不能满足所有的临床需求，因此针对该类疾病的治疗方法的需求变得越来越迫切。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种调节补体成分c5 mrna和蛋白表达的sirna、其缀合物和药物组合物及用途，通过特异性的sirna与c5 mrna结合，抑制mrna的翻译，从而抑制c5蛋白的表达。

2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、本发明第一方面提供一种sirna，其包括正义链和反义链，所述sirna中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述正义链包括如下序列或与如下序列不超过3个碱基突变的核苷酸序列，所述反义链包括如下序列或与如下序列不超过5个碱基突变的核苷酸序列。

4、根据一种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:8，所述反义链的序列如seqid no:84。

5、根据另一种实施方式，所述正义链的序列seq id no:2，所述反义链的序列如seqid no:78。

6、根据再一种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:55，所述反义链的序列如seq id no:131。

7、根据再一些实施方式，所述正义链的序列如seq id no:1，所述反义链的序列如seq id no:77；或者，所述正义链的序列如seq id no:3至7中任一项，所述反义链的序列如seq id no:79至83中任一项；或者，所述正义链的序列如seq id no:9至54中任一项，所述反义链的序列如seq id no:85至130中任一项；或者，所述正义链的序列如seq id no:56至76中任一项，所述反义链的序列如seq id no:132至152中任一项。

8、根据再一种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:169，所述反义链的序列如seq id no:170。

9、根据再一种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:171，所述反义链的序列如seq id no:172。

10、根据某些实施方式，所述正义链包括与上述核苷酸序列中的任一条不超过2个碱基突变的核苷酸序列，不超过1个碱基突变的核苷酸序列。

11、根据某些实施方式，所述正义链的碱基突变可以在核苷酸序列的任意位置，例如第一位、第二位、第三位、第四位、第五位、第六位、第七位、第八位、第九位、第十位、第十一位、第十二位、第十三位、第十四位、第十五位、第十六位、第十七位、第十八位、第十九位中的任意一位、两位或三位。

12、根据某些实施方式，所述反义链包括与上述核苷酸序列中的任一条不超过5个碱基突变的核苷酸序列，不超过4个碱基突变的核苷酸序列，不超过3个碱基突变的核苷酸序列，不超过2个碱基突变的核苷酸序列，不超过1个碱基突变的核苷酸序列。

13、根据某些实施方式，所述反义链的碱基突变可以在核苷酸序列的任意位置，例如第一位、第二位、第三位、第四位、第五位、第六位、第七位、第八位、第九位、第十位、第十一位、第十二位、第十三位、第十四位、第十五位、第十六位、第十七位、第十八位、第十九位、第二十位、第二十一位中的任意一位、两位、三位、四位或五位。

14、根据某些实施方式，按照5’到3’的方向，所述正义链的碱基突变在其核苷酸序列的3’末端，所述反义链的碱基突变在其核苷酸序列的5’末端、第2～8位、3’端最后两位中的任意一位或多位。

15、根据某些实施方式，所示碱基突变包括碱基的替换、插入或者缺失。

16、根据某些实施方式，按照5’到3’的方向，所述正义链的碱基突变在其核苷酸序列的3’末端，所述反义链的碱基突变在其核苷酸序列的5’末端。

17、在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸、2’-氟代修饰的核苷酸、2’-o-ch2-ch2-o-ch3修饰的核苷酸、2’-o-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸、2’-ch2-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸、2’-脱氧基核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、硫代磷酸酯键修饰的核苷酸、vp修饰的核苷酸、lna、ena、cet bna、una、gna或safe-01中的一种或多种的组合，其中，safe-01所示结构式中的r1为h、oh或ch3，base为天然核碱基、修饰的核碱基、通用碱基或h原子。

18、在某些实施方案中，所述正义链中的修饰核苷酸的个数为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个或十九个。

19、在某些实施方案中，所述反义链中的修饰核苷酸的个数为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或二十一个。

20、在某些实施方案中，所述正义链和所述反义链中的全部的核苷酸为修饰的核苷酸。

21、在某些实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8和9位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

22、在另一些实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8和9位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，所述反义链的5’末端的磷酸基团被vp取代，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

23、在又一些实施方式中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8和9位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、14和16位，反义链的第6位为safe-01，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

24、在又一些实施方式中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8和9位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，反义链的第7位为safe-01，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

25、在又一些实施方式中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8和9位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，所述反义链的5’末端的磷酸基团被vp取代，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、14和16位，反义链的第6位为safe-01，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

26、在又一些实施方式中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

27、在上述各类实施方式中，进一步地，所述sirna中以下核苷酸之间的连接中至少一个为硫代磷酸酯基连接：

28、所述正义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

29、所述正义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

30、所述正义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

31、所述正义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

32、所述反义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

33、所述反义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

34、所述反义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

35、所述反义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。

36、进一步地，按照5’到3’的方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

37、所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

38、所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

39、所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

40、所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

41、或者，

42、所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

43、所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

44、所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。

45、进一步地，按照5’到3’的方向，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

46、所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

47、所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

48、所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

49、所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。

50、在某些实施方案中，所述sirna选自表1或表2中的sirna。

51、本发明第二方面提供一种sirna缀合物，其包括上述sirna中的一条或多条，以及缀合至所述sirna的任意位置的一个或多个缀合基团。

52、根据某些实施方式，所述sirna的任意位置连接两个、三个或四个连续连接的所述缀合基团。

53、根据某些实施方式，所述缀合基团连接在所述正义链的3’末端和/或5’末端。

54、根据某些实施方式，所述sirna缀合物具有以下结构中的任一种：

55、

56、

57、

58、

59、本发明的sirna与n-乙酰半乳糖胺残基偶联，通过去唾液酸糖蛋白受体介导肝细胞特异性摄取，可以维持较长时间的半衰期，从而延长药效时间。

60、根据某些实施方式，所述sirna缀合物选自表6、表9、表11、表12、表13、表14或表15所示的sirna缀合物。

61、本发明第三方面提供一种药物组合物，其包括上述sirna或上述sirna缀合物，以及药学上可接受的载体或辅料。

62、在某些实施方案中，所述药物组合物用于调节补体c5的表达。

63、本发明第四方面提供上述sirna，或上述sirna缀合物，或上述药物组合物用于制备调节补体c5表达的药剂的用途。

64、本发明第五方面提供上述sirna，或上述sirna缀合物，或上述药物组合物用于制备治疗和/或预防补体c5的表达相关疾病的药剂的用途。

65、根据某些实施方式，所述疾病包括阵发性夜间血红蛋白尿、非典型溶血性尿毒综合征、老年性黄斑变性、重症肌无力、iga肾炎、视神经脊髓炎和c3肾小球疾病。

66、本发明第六方面提供一种调节补体c5表达的方法，包括将治疗有效量的本发明的sirna，或本发明的sirna缀合物，或本发明的药物组合物与表达c5的细胞接触或给予有需要的受试者。

67、本发明还提供了一种治疗和/或预防补体c5表达相关联的疾病的方法，包括将治疗有效量的本发明的sirna，或本发明的sirna缀合物，或本发明的药物组合物给予有需要的受试者。

68、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

69、本发明提供的sirna、sirna缀合物和药物组合物在细胞实验和动物实验中显示出优异的补体c5表达抑制活性，具有良好的治疗补体c5表达相关联的疾病的潜力。例如，本发明的sirna、sirna缀合物和药物组合物组织特异性好，安全性高；药效持续时间长，皮下给药，用药依从性高；与现有同类型的药物相比，药效和安全性都有很大的提升。